羅威明 單文姣 張子敬 郝一

·論 著·

不同形態(tài)亞型的結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌病理組織中VEGF、微血管密度表達(dá)及其臨床意義

羅威明 單文姣 張子敬 郝一

目的 探討不同形態(tài)亞型的結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌病理組織中VEGF、微血管密度表達(dá)及患者預(yù)后生存情況。方法 收集2008年3月至2010年11月行手術(shù)切除的癌癥組織標(biāo)本103份，研究對象根據(jù)肝癌大體形態(tài)分為3組：單個結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌組（SN組），多結(jié)節(jié)融合型細(xì)胞癌組（CM組）和單個結(jié)節(jié)外生長細(xì)胞癌組。SP免疫組化法分析癌癥組織VEGF陽性表達(dá)情況；免疫組化分析微血管密度（MVD）；Western印跡檢測組織中p-Akt表達(dá)情況；采用Kaplan-Meier生存分析3種亞型患者近4年的生存情況。結(jié)果 CM組、SNEG組患者VEGF陽性表達(dá)率（CM組為78.95％，SNEG組為92.00％）以及MVD表達(dá)（CM為11.77±1.37，SNEG組為19.83±2.06）高于SN組（VEGF陽性表達(dá)率為67.80％，MVD表達(dá)量為6.75±1.21），其中SNEG組同SN組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Western印跡檢測結(jié)果顯示SNEG組p-Akt相對表達(dá)量（0.891±0.059），CM組為（0.681±0.057）均高于SN組（0.421±0.039），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），SNEG組高于CM組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；Kaplan Meier法進(jìn)行生存分析NHC中SN組患者平均生存時間為（3.4±0.3）年，明顯高于CM組（2.1±0.5）年和SNEG組（0.9±0.3）年（P＜0.05），SN組預(yù)后優(yōu)于CM組、SNEG組（P＜0.05）。結(jié)論 單個結(jié)節(jié)外生長細(xì)胞癌患者組織中VEGF、MVD以及p-Akt表達(dá)量高于單個結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌或多結(jié)節(jié)融合型細(xì)胞癌患者組織，可能新生血管的形成與不同亞型結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌患者生存率有一定的關(guān)系。

結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌；血管內(nèi)皮生長因子；微血管密度；p-Akt；生存分析

肝細(xì)胞癌是全球病死率位居第三位的惡性腫瘤之一，術(shù)后患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因［1］。臨床研究顯示，肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與腫瘤組織大小有一定的關(guān)聯(lián)性。其中結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌（NHC）預(yù)后較好［2］，但是，不同形態(tài)亞型NHC患者生存期不盡相同。肝細(xì)胞癌是典型的多血管癌，其發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移與新生血管形成有關(guān)［3］。本文旨在探討不同形態(tài)亞型NHC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后與血管新生的關(guān)系，報(bào)道如下。

資料和方法

一、一般臨床資料

收集2008年3月至2010年11月在長沙醫(yī)學(xué)院腫瘤科、肝膽外科進(jìn)行手術(shù)切除的癌癥組織標(biāo)本103份，所有標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)均為NHC?；颊咧心行?7例，女性16例，年齡37～75歲，平均（58.2±6.9）歲。肝癌組織直徑2.4～5cm，平均為（3.65±0.93）cm，伴有門脈侵襲患者36例。所有研究對象根據(jù)肝癌大體形態(tài)分為3組：單個結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌組（SN組）59例，多結(jié)節(jié)融合型細(xì)胞癌組（CM組）19例，單個結(jié)節(jié)外生長細(xì)胞癌組（SNEG組）25例。所有患者在手術(shù)切除癌組織前均為接受放療、化療以及抗癌藥物等相關(guān)治療，同時告知患者本研究的獲益及風(fēng)險、簽訂知情同意書，報(bào)醫(yī)院倫理委員會審批同意。術(shù)后隨訪3～4年，平均隨訪時間（24.6±6.9）個月。

二、檢測指標(biāo)及方法

（一）免疫組化學(xué)染色法檢測組織中VEGF表達(dá)選用兔抗人VEGF多克隆抗體，采用SP法檢測組織中VEGF表達(dá)（二步法試劑盒以及DAB顯色系統(tǒng)均購自美國Santa Cruze公司）。實(shí)驗(yàn)步驟為：組織經(jīng)脫水、蠟封呈塊狀后切成4μm的薄片，放入到60℃烘箱中過夜，經(jīng)二甲苯脫蠟后、梯度乙醇進(jìn)行脫水，3％過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，血清進(jìn)行封閉；4℃冰箱一抗（1∶50工作濃度）孵育過夜，PBS清洗，二抗孵育4h后加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB染色，封片后鏡檢。陰性對照組以PBS作為一抗。每張切片選取5個200倍視野，采用高倍電子顯微鏡進(jìn)行拍攝，以及Image-Pro Plus6.0軟件計(jì)算每張切片視野中陽性表達(dá)部分的平均吸光度值（OA）以及累積吸光度值（IA）。

（二）Western印跡檢測p-Akt的表達(dá)肝癌組織經(jīng)活檢取出，通入液氮研磨使細(xì)胞充分破裂，將破碎的組織裝入玻璃混勻器中，按照100μL/10ng加入適量裂解液（含PMSF），冰上孵育30 min，然后4℃，以12 000r/min離心5 min，上清液-80℃保存?zhèn)溆?。組織總蛋白經(jīng)考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行定量。組織蛋白質(zhì)樣品加入1/4倍量5×SDS上樣緩沖液進(jìn)行混勻，煮沸變性6min左右，10％SDS-PAGE115 進(jìn)行電泳，210mA恒流1h 40min濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜（NC膜）上。5％脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉3h，加抗p-Akt單抗（鼠抗人，1∶500）。TBST洗膜3次，每次10min，然后與結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室溫孵育1h，TBS洗膜3次，每次10min，最后采用發(fā)光試劑盒ECL反應(yīng)，X膠片曝光顯影。

（三）計(jì)數(shù)肝癌患者微血管密度（MVD）采用免疫組化法檢測各組肝癌組織微血管密度。10％甲醛固定后，乙醇脫水，石蠟包埋等，鼠抗Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體為第一抗體進(jìn)行免疫組化檢測，根據(jù)Weidner報(bào)道的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行，每個切片隨機(jī)選取5個視野現(xiàn)在低倍鏡放大視野（20×20倍），再在200倍視野下計(jì)數(shù)染成棕色血管的數(shù)目，累計(jì)后取平均值作為每個視野的血管密度。統(tǒng)計(jì)不同組別患者VEGF陽性表達(dá)例數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，數(shù)據(jù)之間采用配對t檢驗(yàn)，而對于計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，采用Kaplan Meier法進(jìn)行生存分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用Long-rank test進(jìn)行，所有數(shù)據(jù)均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、不同組別患者組織中VEGF表達(dá)比較

研究結(jié)果顯示，CM組、SNEG組患者VEGF表達(dá)陽性患者例數(shù)高于SN組，其中SNEG組同SN組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1。

二、不同組別組織中MVD表達(dá)情況

研究顯示，不同亞型肝組織中MVD表達(dá)量不盡相同。MVD表達(dá)量CM組為（11.77±1.37）、SNEG組為（19.83±2.06）高于SN組（6.75±1.21），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.43、12.19，P=0.029、0.001）；而SNEG組高于CM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.27，P ＜0.05），見圖2。

圖1 SP免疫組化檢測各形態(tài)肝癌組織中 VEGF表達(dá)（×400）

圖2 免疫組化檢測各形態(tài)肝癌組織中 MVD表達(dá)（×200）

表1 不同組別肝癌組織 VEGF表達(dá)結(jié)果比較

三、Western印跡檢測組織中p-Akt表達(dá)

Western印跡檢測結(jié)果顯示，患者組織中p-Akt表達(dá)量SNEG組為0.891±0.059、CM組為0.681±0.057明顯高于SN組0.421±0.039，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.21，P＜0.05或t=10.76，P＜0.01），SNEG組高于CM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.15，P ＜0.05），見圖3。

圖3 Western印跡檢測各形態(tài)肝癌組織中 VEGF表達(dá)（×200）

四、不同亞型NHC患者預(yù)后情況分析

采用Kaplan Meier法進(jìn)行生存分析，繪制生存曲線，Long-rank檢驗(yàn)3組患者生存曲線。結(jié)果顯示，NHC中SN組患者平均生存時間為（3.4±0.3）年，明顯高于CM組（2.1±0.5）年和SNEG組（0.9±0.3）年（P＜0.05）。SN組、CM組以及SNEG組4年內(nèi)生存率分別為72.8％，50.3％以及29.7％。通過生存曲線顯示，SN組預(yù)后優(yōu)于CM組、SNEG組（P＜0.05），而生存率方面3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

圖4 3組患者生存曲線

討論

目前采用諸如血管介入療法、射頻消融治療、放療等以及采用一些新藥如索拉菲尼等治療肝細(xì)胞癌雖然取得了一定進(jìn)展［4］，但其生存率仍舊不理想，手術(shù)切除和肝移植是目前較為公認(rèn)的治療肝細(xì)胞癌的有效方式［5］。由于結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌采用手術(shù)治療后其預(yù)后較好，因此臨床研究不同治療方法對于結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌與生存期的關(guān)系成為熱點(diǎn)。有報(bào)道指出，單個結(jié)節(jié)伴有外生長型患者出現(xiàn)門靜脈癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良反應(yīng)高于其他亞型［6］。

血液供應(yīng)是實(shí)體腫瘤生長、發(fā)展以及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的必要條件。有研究顯示，腫瘤患者瘤組織中MVD可以作為衡量腫瘤出現(xiàn)浸潤、復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移等生物特異性有關(guān)，肝癌患者中高M(jìn)VD相對于低MVD患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的概率明顯增高，這說明在肝癌患者組織中高M(jìn)VD表達(dá)將進(jìn)一步導(dǎo)致殘癌組織以及剩余癌細(xì)胞生長、發(fā)展等［7-8］。本研究顯示，不同亞型患者肝癌組織中MVD表達(dá)明顯不同，其中SNEG組患者中MVD表達(dá)量明顯高于SN組、CM組。單個結(jié)節(jié)外生長型患者出現(xiàn)高M(jìn)VD可能與其預(yù)后差有一定的關(guān)聯(lián)性。VEGF是近些來年來用于研究腫瘤血管生成的熱門因子之一。肝癌是典型的多血管腫瘤，有報(bào)道曾指出肝癌患者中85.7％VEGF表達(dá)呈陽性［9］，而這些陽性表達(dá)患者中有50％的患者出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移，而VEGF陰性患者出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移的比率明顯低于陽性表達(dá)患者，正常肝臟中VEGF表達(dá)為陰性，而肝癌組織中其陽性標(biāo)率達(dá)到63.3％，腫瘤細(xì)胞可以分泌血管內(nèi)皮生長因子，從而促進(jìn)新生血管的生成，進(jìn)一步導(dǎo)致癌細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［10］。此外，VEGF的高表達(dá)也是組織中形成新生血管以及維持血管滲透性的標(biāo)志物，其與組織中微血管形成、密度有直接關(guān)系［11］。本研究顯示，不同亞型結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌患者VEGF表達(dá)情況不盡相同，其中SN組出現(xiàn)陽性表達(dá)患者比率高于CM組、SNEG組，說明當(dāng)結(jié)節(jié)型肝癌出現(xiàn)外生長時，其血管新生也出現(xiàn)高度表達(dá)。

肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展與多種細(xì)胞信號途徑有關(guān)。其中PI3K/Akt信號通路與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PI3K/Akt信號通路廣泛存在于機(jī)體內(nèi)各細(xì)胞內(nèi)，其在惡性腫瘤細(xì)胞增殖、新生血管形成以及侵襲轉(zhuǎn)移等方面起著重要的作用［12］。研究顯示，腫瘤微環(huán)境下產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子均可以刺激該通路磷酸化，如血小板源生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等［13］。以往的研究也證實(shí)肝細(xì)胞癌與Akt磷酸化有一定的關(guān)聯(lián)系，但鮮為報(bào)道結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌不同亞型血管新生情況，以及引起血管異常新生的分子機(jī)制［14］。通過本研究顯示，SNEG組、CM組患者組織中p-Akt表達(dá)量明顯高于SN組。Akt磷酸化將進(jìn)一步刺激下游細(xì)胞因子以及細(xì)胞器反應(yīng)，從而促進(jìn)血管新生。本研究發(fā)現(xiàn)，不同亞型結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌患者中血管新生現(xiàn)象并不一致，其中出現(xiàn)外生型患者血管新生現(xiàn)象更為明顯，也有報(bào)道顯示單個結(jié)節(jié)外生型肝癌患者生存期低于單個結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌或多結(jié)節(jié)融合型細(xì)胞癌［15］，這也說明結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌患者出現(xiàn)明顯的血管新生與其預(yù)后生存有一定的關(guān)聯(lián)性。

總之，單個結(jié)節(jié)外生長細(xì)胞癌患者組織中VEGF、MVD以及p-Akt表達(dá)量高于單個結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌或多結(jié)節(jié)融合型細(xì)胞癌患者組織，可能新生血管的形成與不同亞型結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞癌患者生存率有一定的關(guān)系。

1 Zhu JY，Sun QK，Wang W，et al.High-level expression of HOXB13 is closely associated with tumor angiogenesis and poor prognosis of hepatocellular carcinoma.Int J Clin Exp Pathol，2014，7：2925-2933.

2 王時俊，陳潔，彭寧福，等.E-鈣黏蛋白和上皮細(xì)胞黏附分子在結(jié)節(jié)型肝細(xì)胞性肝癌大體形態(tài)亞型中的表達(dá)及相關(guān)性研究.中國癌癥防治雜志，2013，5：42-46.

3 劉金鋼，李巖，劉丹，等.HSP70與PI3K/Akt信號通路在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)及意義.中華肝臟外科手術(shù)學(xué)電子雜志，2013，2：45-62.

4 Choi SB，Park JB，Song TJ，et al.Molecular mechanism of HIF-1-independent VEGF expression in a hepatocellular carcinoma cell line.Int J Mol Med，2011，28：449-454.

5 伏旭，何健，史炯，等.肝細(xì)胞癌大體形態(tài)分型的臨床意義.中華消化外科雜志，2015，14：120-127.

6 Jain S，Singhal S，Lee P，et al.Molecular genetics of hepatocellular neoplasia.Am J Transl Res，2010，2：105-118.

7 Zhou S，Tan C，Dai Z，et al.Tacrolimus enhances the invasion potential of hepatocellular carcinoma cells and promotes lymphatic metastasis in a rat model of hepatocellularcarcinoma：involvement of vascular endothelial growth factor-C.Transpl Proceedings，2011，43：2747-2754.

8 Lee JY，Kim YS，Rhim H，et al.Pattern and chronological change of iodized oil retention in radiofrequency ablation-induced vascular injury area：differentiation from iodized oil retention in recurrent hepatocellular carcinoma on computed tomography.J Computer Assisted Tomography，2010，34：354-361.9 Shi J，He YY，Sun JX，et al.The impact of sphingosine kinase 1 on the prognosis of hepatocellular carcinoma patients with portal vein tumor thrombus.Ann Hepatol，2015，14：198-206.

10 Calderaro J，Azoulay D，Zafrani ES.Hepatocellular carcinomaand nodular regenerative hyperplasia after chemotherapy for metastatic colorectal carcinoma.Hepatology，2014，60：1440-1441.

11 Xiang ZL，Zeng ZC，F(xiàn)an J，et al.Gene expression profiling of fixed tissues identified hypoxia-inducible factor-1α，VEGF，and matrix metalloproteinase-2 as biomarkers of lymph node metastasis in hepatocellular carcinoma.Clin Cancer Res，2011，17：5463-5472.

12 Tsujita E，Yamashita Y，Takeishi K，et al.The Clinieopathological Impact of Gross Classification on Solitary Small Hepatocellular Carcinoma.Hepatogastroenterology，2013，60：1726-1730.

13 Kopetz S，Lesslie DP，Dallas NA，et al.Synergistic Activity of the Src Family Kinase Inhibitor Dasatinib and Oxaliplatin in Colon Carcinoma Cells is Mediated by Oxidative Stress.Cancer Res，2009，69：3842-3849.

14 Nakayama H，Takayama T，Okubo T，et al.Proposal of objective morphological classification system for hepatocellular carcinoma using preoperative muhiphase computed tomography.J Gastroenterol，2014，49：1430-1437.

15 Qiu Y，Zhu X，Zhu R，et al.The clinical study of precise hemihepatectomy guided by middle hepatic vein.World J Surg，2012，36：2428-2435.

VEGF and MVD in pathological tissues of different forms of nodular HCCsubtypes and their clinical significance

LUO Wei-ming，SHAN Wen-jiao，ZHANG Zi-jing，HAO Yi.Department of Pathology，Institute of Basic Medical Sciences，Changsha Medical University，Changsha 410219，China

Objective To investigate vascular endothelial growth factor（VEGF）and microvessel density（MVD）in pathological tissues of different forms of nodular hepatocelluar carcinoma（NHC）subtypes，and to study their relationship with prognosis of the NHC patients.Methods A total of 103 patients，with NHC，which underwent surgical resection at the department of oncology and hepatobiliary surgery in our hospital from March 2008 to November 2010，were enrolled.According to the general form of liver cancer，study subjects were divided into three groups，including single nodular HCC group（SN group），multinodular converged cell carcinoma group（CM group）and single extranodule growth cell carcinoma group（SNEG group）.Detections of VEGF and MVD in cancer tissue were carried out by SP immunohistochemical and immunohistochemical methods，respectively.Western blot was conducted to measure the expression of p-Akt in tissues.Survival for nearly four years of patients in three subtypes was analyzed by Kaplan-Meier survival analysis，respectively.Results Compared to SN group，there were more VEGF positive patients with higher levels of MVD expression in CM and SNEG group，and there was a statistically significant difference（P＜0.05）among SNEG and SN groups.Western blot showed that p-Akt expression fromLiver tissues in SNEG and CM groups was significantly higher than that in SN group（P ＜0.05 or P＜0.01），and p-Akt expression in SNEG group was significantly higher than that in CM group（P＜0.05）.Kaplan Meier survival analysis of NHC patients showed that average survival time for patients in SN group was 3.4±0.3 years，which was significantly higher than those in CM（2.1±0.5 years）and SNEG（0.9±0.3 years）（P＜0.05）groups.In addition，the prognosis in SN group was better than those in CM and SNEG groups（P＜0.05）.Conclusion Levels of VEGF，MVD and p-Akt expression in SNEG group were higher than those in SN and CM groups，which showed that there might be a certain relationship between the newborn blood vessel formation and the survival rate of patients with NHC in different subtypes.

Nodular hepatocellular carcinoma；Vascular endothelial growth factor；Microvessel density；P-Akt；Survival analysis

2015-04-27）

（本文編輯：賴榮陶）

2014年湖南省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（14C0116）；2014年湖南省普通高等學(xué)校教學(xué)改革研究項(xiàng)目（554）作者單位：410219 長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系病理教研室

郝一，Email：haoyi5000@163.com