劉榮火　周　宇　郭中秋　謝麗華　陳曉紅　胡紅松　俞紅華

胃腺癌組織維生素D3上調(diào)蛋白1表達(dá)與核因子-資B活性關(guān)系研究

劉榮火1周宇2郭中秋1謝麗華1陳曉紅1胡紅松1俞紅華1

目的探討胃腺癌組織維生素D3上調(diào)蛋白1（VDUP1）表達(dá)情況及其與核因子-資B（NF-資B）活性關(guān)系。方法分別取胃腺癌患者腫瘤組織及癌旁組織，病理檢查確診，凝膠遷移率變動(dòng)分析（EMSA）測(cè)NF-資B活性，RT-PCR檢查VDUP1表達(dá)。結(jié)果胃腺癌組織的NF-資B活性（10 701.0 ±3 529.4）與癌旁組織（7 961.5±1601.2）比較，差異有顯著性（P＜0.01）；胃腺癌組織VDUP1表達(dá)減少，與癌旁組織VUDP1表達(dá)情況比較，差異有顯著性（P＜0.01）。結(jié)論胃腺癌組織VDUP1表達(dá)降低，NF-資B活性升高，VDUP1表達(dá)與NF-資B活性呈負(fù)相關(guān)。VDUP1對(duì)NF-資B活性可能具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。

胃腺癌；維生素D3上調(diào)蛋白1；核因子-資B

胃腺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高且早期診斷存在困難，中晚期患者治療效果欠理想，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。NF-資B是一種核蛋白因子，在生物體生長(zhǎng)、凋亡和分化等過(guò)程中起非常重要的作用，不少研究認(rèn)為NF-資B是胃腺癌發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一。維生素D3上調(diào)蛋白1（Thioredoxin binding protein/vitamin D3upregulated protein 1，VDUP1）能與抗氧化劑硫氧還蛋白相互作用，對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生影響，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在多種腫瘤組織中它的表達(dá)顯著減少，是一個(gè)候選腫瘤抑制基因，是目前的研究熱點(diǎn)。本文擬對(duì)胃腺癌組織中VDUP1表達(dá)情況及其與NF-資B活性的關(guān)系進(jìn)行研究。

材料與方法

一、病人資料與主要材料

病例來(lái)源于2013年7月至2015年6月在我院消化內(nèi)科及消化內(nèi)鏡中心就診的患者。遵循知情同意原則，胃腺癌組25例（男17例、女8例，中位年齡63.4歲）；實(shí)驗(yàn)所用的胃腺癌病例的診斷、分期等標(biāo)準(zhǔn)采用2010年第3版日本《胃癌治療指南》。取部分鏡下典型病例患者癌旁組織10例（男7例、女3例，平均年齡61.7歲），EMSA試劑盒（promega公司）；［γ-32p］ATP（5 000 Ci/mmol，10 mCi/ml，北京福瑞）；Trizol RNA抽提試劑及RT（逆轉(zhuǎn)錄）試劑盒（由invitrogen公司提供）。

二、標(biāo)本選取

標(biāo)本來(lái)源于胃鏡檢查和活檢，先鉗取癌旁組織，后鉗取腫瘤病灶；病理診斷為胃腺癌者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)組，癌旁組織取標(biāo)本作為對(duì)照組。

三、EMSA法檢測(cè)NF-資B活性

按下列順序進(jìn)行：①提取及定量核蛋白；②探針標(biāo)記純化；③4%非變性聚丙烯酰胺凝膠配制；④結(jié)合反應(yīng)；⑤0.5 X TBE電泳液，恒壓180 V電泳90 min。剝離膠片，電燈烤干，磷屏曝光20 h。同位素成像分析系統(tǒng)活性值（灰度值）。

四、RT-PCR法檢測(cè)VUDP1表達(dá)

按Trizol試劑盒和RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作抽提總RAN和RT-PCR檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［1］。VUDP1：擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為236 bp，上游引物5′-GCA ATC ATA TT A TCT CAG GGA C-3′，下游引物5′-CAT CTC AGA GCT GGT TCG-3′。β-actin：擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為393 bp，β-actin上游引物5′-GAA ATC GTG CGT GAC AAT AA-3′，β-actin下游引物5′-GTA CTT GCG CTC AGG AGG-3′。PCR反應(yīng)總體積50滋L，先反轉(zhuǎn)錄，溫度42℃，時(shí)間60 min；合成的cDNA，同時(shí)擴(kuò)增β-actin和VDUPl，94℃30 s，50．5℃60 s，72℃60 s，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取10滋L RT-PCR產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，電泳結(jié)果用Band Scan 5.0軟件進(jìn)行光密度積分值分析，計(jì)算出VDUPl與內(nèi)參照βactin的光密度積分值之比作為VDUPl mRNA表達(dá)相對(duì)含量值（灰度比）。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)分析軟件；所有參數(shù)用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

結(jié)果

一、各段組織NF-資B活性比較

胃腺癌組織的NF-資B活性顯著增強(qiáng)，與癌旁組織比較，差異有顯著性（P＜0.01），見(jiàn)表1和圖1。

表1　各組胃黏膜組織NF-資B活性比較

表1　各組胃黏膜組織NF-資B活性比較

注：△與胃腺癌組比較，差異有顯著性（P＜0.01）。

組別n活性值癌旁組織10　7961.5±1601.2△胃腺癌組2510701.0±3529.4

圖1　兩組胃黏膜NF-κB活性

二、胃腺癌組織和癌旁組織VDUP1mRNA表達(dá)情況見(jiàn)圖2。

圖2　兩組VDUP1 mRNA的表達(dá)情況

討論

硫氧還蛋白（Trx）是一種強(qiáng)力抗氧化劑，在細(xì)胞增殖、凋亡、基因表達(dá)和癌細(xì)胞活動(dòng)等過(guò)程中扮演多重角色。Trx還能抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-1（ASK-1），具有抗細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡因子的功能。還有研究認(rèn)為T(mén)rx可改變與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、AP-1、TF-KC、糖皮質(zhì)激素受體和BZLF1等。Trx在肺癌、子宮頸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等癌癥組織中表達(dá)增高，并且表達(dá)水平與腫瘤生長(zhǎng)呈正相關(guān)。多種癌細(xì)胞分泌Trx，誘導(dǎo)其自身生長(zhǎng)。此外，Trx還與抗癌藥物的耐藥性有關(guān)。VDUP1又稱為硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interaction protein，TXNIP）或硫氧還蛋白結(jié)合蛋白-2（thioredoxin binding protein-2，TBP-2），是一種多功能的46-kDa蛋白，除了參與多種氧化應(yīng)激反應(yīng)，還具有多種生物學(xué)功能，是Trx內(nèi)源性抑制因子。VDUP1與Trx活性區(qū)的兩個(gè)半胱氨酸殘基結(jié)合，抑制Trx的活性，VDUP1高表達(dá)時(shí)Trx活性降低近50%。VDUP1與Trx相互作用可抑制Trx的還原活性，阻止Trx與其它因子如ASK-1和PAG的相互作用；從而使細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激變得脆弱。VDUP1表達(dá)增加還會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制Trx與ASK-1的結(jié)合，從而使ASK-1從Trx分離，ASK-l得到活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。PAG又稱過(guò)氧化物酶1，它是硫醇基特異性抗氧化劑，可以抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞繁殖。當(dāng)細(xì)胞中存在Trx時(shí)，PAG作為中間電子供體還原HO2。但當(dāng)細(xì)胞中VDUP1高表達(dá)時(shí)，PAG與Trx之間的作用減少近60%，此時(shí)細(xì)胞易受氧化應(yīng)激損傷而發(fā)生凋亡。另外，VDUP1的異位表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程。VDUP1表達(dá)增高時(shí)，細(xì)胞周期停滯，腫瘤細(xì)胞繁殖受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)VDUP1在人類許多腫瘤如乳腺癌、胃腸癌、腎細(xì)胞癌和惡性嗜鉻細(xì)胞瘤、人類T細(xì)胞白血病和高級(jí)別的B細(xì)胞淋巴瘤的的表達(dá)水平降低［2］。因此，它已成為近年腫瘤研究的重要靶點(diǎn)。

NF-κB是炎癥的中心環(huán)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)一過(guò)性炎性信號(hào)通過(guò)一個(gè)正反饋環(huán)路包括NF-κB、Lin28、let-7和IL-6可以啟動(dòng)一個(gè)從非轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的開(kāi)關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子IL-6激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3，STAT3通過(guò)直接激活miR-21和miR-181b-1起到抑制PTEN與CYLD腫瘤抑制基因作用，從而增加維持轉(zhuǎn)化狀態(tài)所需的NF-κB活性［3］。胱天蛋白酶相關(guān)募集域6（Caspase-associated recruitment domain 6（CARD6））作為一種由RIP1、RIP2、Bcl-10和MEKK誘發(fā)后能激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)，在胃腺癌、結(jié)腸腺癌中呈高表達(dá)［4］。不少研究［5-6］發(fā)現(xiàn)胃腺癌組織的NF-κB活性較正常組織顯著升高。活化的NF-κB能通過(guò)調(diào)節(jié)c-myc、cyclinD1、bcl-xl、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和Ku蛋白等多種途徑［7-8］參與胃腺癌的發(fā)生。VUDP1作為候選腫瘤抑制基因，具有通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)NF-κB的作用。如Kwon HJ等［9］發(fā)現(xiàn)，VDUP1抑制TNF-α和p65蛋白誘導(dǎo)的NF-κB活化，VDUP1喪失促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化，而TNF-α能下調(diào)VDUP1表達(dá)。組蛋白去乙?；福℉DAC）通過(guò)結(jié)合到NF-κB的p50或p65亞基抑制NF-κB活性，VDUP1能協(xié)同HDAC1和HDAC3抑制p65的誘導(dǎo)的NF-κB活化。此外，VDUP1還通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB活性，與不同的細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)聯(lián)，抑制細(xì)胞增殖。有研究發(fā)現(xiàn)VDUP1表達(dá)降低大大增加NF-κB活性。而細(xì)胞周期蛋白D1是NF-κB的最重要的轉(zhuǎn)錄靶，NF-κB的活性增加是增加細(xì)胞增殖的原因之一。研究認(rèn)為VDUP1在控制肝細(xì)胞再生的啟動(dòng)中起一定作用［7］，VDUP1缺陷的腫瘤細(xì)胞增殖增加，VDUP1喪失促進(jìn)肝癌發(fā)生［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織的VUDP1表達(dá)較癌旁組織顯著降低，相應(yīng)的胃腺癌組織的NF-κB活性較癌旁組織顯著升高，與目前研究結(jié)果有一致性［8］。提示在胃腺癌組織中的VUDP1表達(dá)降低，且其與NF-κB活性存在負(fù)相關(guān)。鑒于活檢標(biāo)本體積存在一定的差異，且深圳地區(qū)不少患者診斷腫瘤后回當(dāng)?shù)蒯t(yī)院治療等特殊情況，對(duì)患者的腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等情況的診斷等存在困難與不足，在未來(lái)的工作中需要進(jìn)一步調(diào)整研究方案。

1高楓，蔡紹曦，鄒飛，等.硫氧還蛋白結(jié)合蛋白-2/維生素D3上調(diào)蛋白1在哮喘病人外周血嗜酸性粒細(xì)胞的表達(dá).南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26（4）：371-375.

2黨英男，劉曉慧，白潔.硫氧還蛋白結(jié)合蛋白-2與腫瘤的關(guān)系.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010，30（22）：3414-3416.

3Iliopoulos D，Jaeger SA，Hirsch HA，et al.STAT3 activation of miR-21 and miR-181b-1 via PTEN and CYLD are part of the epigenetic switch linking inflammation to cancer.Mol Cell，2010，39（4）：493-506.

4Kim SS，Ahn CH，Kang MR，et al.Expression of CARD6，an NF-kappaB activator，in gastric，colorectal and oesophageal cancers. Pathology，2010，42（1）：50-53.

5Skrzycki M，Scibior-Bentkowska D，Podsiad M，et al.Protein level of transcription factors AP-1 and NF-κB in selected human gastrointestinal tract tumors.Pol Merkur Lekarski，2008，25（150）：510-515.

6劉榮火，周宇，胡紅松，等.H.pylor相關(guān)性萎縮性胃炎和胃腺癌的核因子-kB活性相關(guān)性研究.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（22）：3718-3720.

7Kwon HJ1，Hong SK，Yoon WK，et al.Vitamin D3 up-regulated protein 1 controls the priming phase of liver regeneration.J Vet Sci，2013，14（3）：257-262.

8Woolston CM，Madhusudan S，Soomro IN，et al.Thioredoxin interacting protein and its association with clinical outcome in gastrooesophageal adenocarcinoma.Redox Biol，2013，1：285-291.

9Kwon HJ，Won YS，Suh HW，et al.Vitamin D3 upregulated protein 1 suppresses TNF-α-induced NF-κB activation in hepatocarcinogenesis.J Immunol，2010，185（7）：3980-3989.

2015-02-09）

（本文編輯：肖冰）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.04.042

1 518172深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科；2 524001廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

胡紅松，E-mail：szhhs2010@163.com