邵向麗，趙　爽，劉書亮，李建龍，胡欣潔，趙　勤，何　利，鄧維琴，韓新鋒

（四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

四川麩醋醋醅中優(yōu)良醋酸菌的篩選及其產酸特性

邵向麗，趙爽+，劉書亮*，李建龍，胡欣潔，趙勤，何利，鄧維琴，韓新鋒

（四川農業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

從四川麩醋醋醅中篩選獲得5株高產酸菌株（C9-4、C12-4、A30-16、A12-7和A30-14-2），對其進行形態(tài)學、生理生化鑒定及16S rDNA分子鑒定，結果顯示，5株菌均為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。其產酸特性表明，菌株C9-4、A30-16和A30-14-2能耐受9%（v/v）乙醇；5株菌均能耐受4%（v/v）底酸；補加酒精實驗表明，菌株C9-4的連續(xù)產酸能力最強；菌株C9-4、A30-16、A30-14-2在40℃時仍能產酸；相同條件下，菌株C9-4、A30-16、A30-14-2產酸速率優(yōu)于菌株C12-4和A12-7。5株醋酸菌產酸總量從高到低依次為：A30-16＞C12-4＞C9-4＞A30-14-2＞A12-7。

四川麩醋，醋酸菌，篩選，鑒定，特性

食醋作為一種重要的傳統(tǒng)調味品，不僅具有特殊的風味，而且對一些食源性致病細菌具有一定的抑制作用［1］，長期食用還能達到緩解疲勞、調節(jié)血糖、脂質代謝及促進食欲的功效［2］。四川麩醋以麩皮等為主要原料，采用生料固態(tài)發(fā)酵的傳統(tǒng)工藝，以獨特的藥曲加黑曲為糖化劑，加入酵母菌與麩皮拌和后入池發(fā)酵，主要依靠環(huán)境中的醋酸菌進行，發(fā)酵周期一個月以上［3-4］。四川麩醋的傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工藝在實際生產中存在淀粉利用率低、生醋酸度低、生產周期長等問題，因此篩選出優(yōu)良的醋酸菌對食醋產業(yè)的發(fā)展至關重要［5-6］。

王電壘等［7］篩選到兩株耐高溫醋酸菌Ⅱ9、Ⅵ13，菌株在40℃酒精中轉化率均可達到73.2%以上；席青等［8］從山西醋醅中篩選出1株優(yōu)勢產酸菌（醋化醋桿菌奧爾蘭亞種），其產酸量為66.92g/L，酒精轉化率為72.42%；Maria Gullo等［9］從意大利香醋中分離出的部分菌株可耐25%高濃度葡萄糖；T T Kadere等［10］從肯尼亞棕櫚酒中篩出的醋酸菌在25～40℃范圍內生長良好；朱其瀚等［11］從鎮(zhèn)江恒順醋廠的醋醅中分離純化出1株巴氏醋桿菌，該菌株能產生3種有機酸：乳酸、乙酸、酒石酸；而許偉從鎮(zhèn)江香醋醋醅中篩選到1株能產乙酸、琥珀酸、焦谷氨酸、α-酮戊二酸、酒石酸5種有機酸的醋酸菌；通過生物強化實驗，菌株總酸最高達到74g/L，出醋率提高7%～25%［12］，與山西陳醋、鎮(zhèn)江香醋等食醋中篩選到的優(yōu)良醋酸菌株相比較，從四川麩醋中篩選優(yōu)良醋酸菌的報道并不多見，陳娟等［13］從四川保寧醋醋醅中篩選出1株惡臭醋桿菌，相同條件下，其產酸量（33.8g/L）明顯低于其他醋酸菌菌株。

本文旨在從四川麩醋傳統(tǒng)生料固態(tài)釀造的醋醅中分離篩選出具有耐高溫、耐酒精、耐底酸的高產酸優(yōu)勢醋酸菌，為食醋生產提供菌種資源。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

醋醅采自四川閬中保寧醋廠不同發(fā)酵期的醋醅；菌株巴氏醋桿菌巴氏亞種（Acetobacter pasteurianus subsp.pasteurianus），CICC編號：7015；惡臭醋桿菌混濁變種1.41（Acetobacter rancens var. turbidans），CICC編號：20064均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；甲醇、乙酸、L-乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸、丙酮酸、L-蘋果酸、琥珀酸均為色譜純；TIANDZ柱式細菌DNAOUT購于四川省綿陽天澤基因工程有限公司；Prem ix Taq、Gold View核酸染料、DNA Marker DL2000、瓊脂糖均購于寶生物工程（大連）有限公司；細菌通用引物，上游引物：5’-AGAG…TTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’ 由上海英駿（invitrogen）生物技術有限公司合成；其他試劑均為分析純。

PCR儀（My CyclerTM Thermal Cycler）Bio-Rad；凝膠成像儀（Quantity One System）Bio-Rad；LC-10A2010C HT型液相色譜儀、LC-solution工作站日本島津公司；氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（Agilent 7890A-5975C）美國安捷倫公司；AS10200A超聲波清洗器天津奧特賽恩斯公司；Milli-Q超純水儀美國密理博公司。

1.2培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基：酵母膏10g，葡萄糖10g，瓊脂粉20g，CaCO320g，蒸餾水1000m L，培養(yǎng)基添加50m L溴甲酚紫溶液，pH為自然，使用前加3%（v/v）無水乙醇。

基礎培養(yǎng)基：酵母膏10g，葡萄糖10g，使用前加入3%（v/v）無水乙醇。

產酸培養(yǎng)基：酵母膏10g，葡萄糖10g，使用前加入7%（v/v）無水乙醇。

斜面保藏培養(yǎng)基：酵母膏10g，葡萄糖10g，瓊脂粉20g，CaCO320g，蒸餾水1000m L使用前加入3%（v/v）無水乙醇。

以上培養(yǎng)基均需121℃，滅菌15m in。

1.3實驗方法

1.3.1醋酸菌的分離篩選流程醋醅→增菌培養(yǎng)→稀釋涂布→分離純化［8］→鏡檢→斜面保藏→產醋酸定性實驗［14］→產酸定量實驗［15］→甘油保種。產酸定量實驗以菌株20064和菌株7015為對照菌株。

1.3.2產醋酸菌株的鑒定通過16S rDNA遺傳學鑒定方法［16］和生理生化、形態(tài)學鑒定方法（參照《伯杰氏細菌鑒定手冊（第8版）》與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》）對菌株進行鑒定。

1.3.3菌株的產酸特性

1.3.3.1不同乙醇濃度對菌株產酸的影響將通過產酸定量實驗篩選得到的高產酸醋酸菌于30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)（22±2）h活化后，分別接種于乙醇含量分別為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%（v/v）的產酸培養(yǎng)基中，30℃、120r/m in振蕩培養(yǎng)72h，測定產酸量。相同條件下，測定菌株20064和7015的產酸量。

1.3.3.2補加乙醇對菌株產酸的影響將通過產酸定量實驗篩選得到的高產酸醋酸菌于30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)（22±2）h活化后，分別接種于乙醇含量為3%（v/v）的基礎培養(yǎng)基中，每隔24h補加1%（v/v）無水乙醇，30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)72h，測定產酸量。相同條件下，測定菌株20064和7015的產酸量。

1.3.3.3不同濃度底酸對菌株產酸的影響將通過產酸定量實驗篩選得到的高產酸醋酸菌于30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)（22±2）h活化后，分別接種于基礎培養(yǎng)基中，底酸（乙酸）濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%（v/v），30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)72h，測定產酸量。相同條件下，測定菌株20064和7015的產酸量。

1.3.3.4不同培養(yǎng)溫度對菌株產酸的影響將通過產酸定量實驗篩選得到的高產酸醋酸菌于30℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)（22±2）h活化后，分別接入產酸培養(yǎng)基后，分別于28、30、35、37、40℃，120r/m in振蕩培養(yǎng)72h，測定產酸量。相同條件下，測定菌株20064和7015的產酸量。

1.3.5產酸曲線的測定將菌株分別接入裝有100m L產酸培養(yǎng)基的300m L的三角瓶中，于30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)10d，每天測一次產酸量。相同條件下，測定菌株20064和7015的產酸量。

1.3.6發(fā)酵液中有機酸的測定將5株菌株（C9-4、C12-4、A12-7、A30-14-2、A30-16）分別接入產酸培養(yǎng)基100m L/300m L的三角瓶中，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)72h，取發(fā)酵液，12000r/m in離心10m in，再取上清液，0.22μm濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液用于HPLC檢測。

色譜條件：Carbomix H-NP 10μm，7.8mm×300mm；柱溫58℃；流動相2.5mmol/L H2SO4；進樣體積10μL，流速0.6m L/m in；檢測波長210nm。

按不同樣品目標峰的峰面積對應的濃度進行定量［17-18］。

2　結果與分析

2.1高產酸菌株的篩選

從自然發(fā)酵的麩醋醋醅中分離純化得到12株產酸菌株，其產酸量均高于對照菌株20064，其產酸量如表1所示，結合菌株分離至不同發(fā)酵天數的醋醅，由表得出菌株C9-4、C12-4、A 12-7、A30-14-2、A30-16為較高產酸菌株，因此選擇該菌株作為后續(xù)實驗的研究對象。

表1　不同菌株的產酸量Table 1　Acid production of different strains

2.2菌株鑒定結果

菌株在碳酸鈣平板上的菌落形態(tài)及鏡檢的個體形態(tài)（10×100）如圖1所示。菌落呈淡黃色或乳白色，菌落形態(tài)圓形、隆起、光滑，邊緣不整齊，5株醋酸菌菌株經革蘭氏染色，在油鏡下進行觀察，其均呈桿狀或短桿狀，單生、對生或呈鏈狀。

圖1　菌株的菌落及個體形態(tài)特征Fig.1　The colony and individual characteristics of strains

對其中5株菌C9-4、C12-4、A12-7、A30-14-2、A30-16進行了生理生化鑒定和16S rDNA遺傳學鑒定，生理生化鑒定結果見表2，從表2中可以看出5株菌均不能在Hoyer-Frateur培養(yǎng)基上生長，不能產5-酮基葡萄糖酸鹽和纖維素，但卻均可產醋酸，C12-4、A12-7菌株可以產葡萄糖酸鹽。

圖2為5株菌16S rDNA的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，經檢測，其片段大小均在1500bp左右，將其測序結果提交NCBI后獲得登錄號，分別是KF707665、KF707666，KF707667、KF707668、KF707669。采用Blast在Genbank中進行相似性比對，并對5株菌構建其系統(tǒng)發(fā)育樹（如圖3所示）。根據形態(tài)學、生理生化指標及16S rDNA序列分析可判定5株菌均為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）。

圖2　菌株16S rDNA的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2　Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA gene PCR products of strains

圖3　基于16S rDNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

2.3菌株的產酸特性

2.3.1菌株對不同酒精濃度的適應性如圖4所示，隨著乙醇含量的增加，菌株的產酸量均呈現(xiàn)先增后減的趨勢。其中，菌株A30-16對乙醇的耐受性較好，在乙醇含量7%時，產酸量最高（55.51g/L），其和對照菌株7015（7%，54.18g/L）相當，優(yōu)于菌株20064（6%，41.81g/L）；菌株C9-4、C12-4和A12-7的產酸量在乙醇含量為6%時最高，分別為45.51、42.98、39.46g/L；菌株A30-14-2的產酸量在乙醇含量為5%時達到最高值（41.54g/L）；菌株C9-4、A30-16和A30-14-2能耐受9%（v/v）乙醇。

2.3.2補加乙醇對菌株產酸的影響以菌株20064及7015作為對照，對5株高產酸醋酸菌進行補加酒精實驗，如圖5所示，補加乙醇后，5株菌的最終產酸量均高于對照菌株20064（34.48g/L）；菌株C9-4的產酸量最高，為43.60g/L，其次分別是菌株C12-4（41.83g/L）、菌株A30-14-2（41.61g/L）、菌株A30-16（41.46g/L）、菌株A12-7（39.83g/L）。

表2　菌株的生理生化鑒定結果Table 2　Physiological and biochemical identification results of different strains

圖4　菌株對不同酒精度濃度的適應性Fig.4　Adaptability of strains to differentalcohol

圖5　補加乙醇對菌株產酸的影響Fig.5　The effectofadding ethanol test to strains producting acid

2.3.3菌株對不同濃度底酸的適應性以菌株20064及7015作為對照，對5株高產酸醋酸菌進行底酸適應性實驗，結果如圖6所示，5株菌均能耐受4%（v/v）底酸；菌株A30-16的產酸量在底酸濃度≤4%的范圍內，隨底酸濃度的增加而增加；其他菌株的產酸量隨底酸濃度的增加均呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢；菌株A30-16、A30-14-2和C9-4對底酸的耐受力較菌株C12-4和A12-7強。

圖6　菌株對不同濃度底酸的適應性Fig.6　Adaptability of strains to differentbottom acid concentration

2.3.4菌株對不同溫度的適應性以菌株20064及7015作為對照，對5株高產酸醋酸菌進行溫度適應性實驗，如圖7所示，在28～40℃范圍內，菌株C12-4的產酸量隨溫度的升高持續(xù)快速減少，菌株A30-14-2隨溫度的升高基本呈等差數列減少；菌株C9-4、A12-7、A30-16的產酸量隨溫度的升高均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，并在34℃達到最高值；菌株C9-4、A 30-14-2和A30-16的產酸量在28～40℃范圍內波動相對較小，對溫度的適應范圍廣，尤其是菌株C9-4、菌株A30-14-2和菌株A30-16能耐受40℃的高溫并產酸，產酸量達到20g/L以上。

圖7　菌株對不同溫度的適應性Fig.7　Adaptability of strains to different temperature

2.3.5菌株的產酸曲線以菌株20064及7015作為對照，繪制5株高產酸醋酸菌的產酸曲線。如圖8所示，菌株A30-14-2、C9-4、A30-16的產酸量在0～5d迅速增加，5～10d緩慢增加；菌株C12-4、A12-7的產酸量在0～10d內呈“S”型變化趨勢，0～3d產酸量基本不增加，3～6d迅速增加，6～10d又呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢。表明菌株A30-14-2、C9-4和A30-16的產酸速率及對環(huán)境的適應性優(yōu)于菌株C12-4和A12-7。

圖8　菌株的產酸曲線Fig.8　Acid producing curve of strains

2.3.6菌株產有機酸情況由表3可知，5株菌株均被檢出5種以上的有機酸，均未檢出乳酸；菌株C9-4、A 12-7未檢出檸檬酸，菌株C9-4、C12-4未檢出蘋果酸；菌株C12-4產酒石酸的量顯著高于其他菌株，菌株A30-16產乙酸的量顯著高于其他菌株；產酸總量從高到低依次為：A30-16＞C12-4＞C9-4＞A30-14-2＞A 12-7。

表3　不同菌株發(fā)酵液中有機酸的含量（mg/mL）Table 3　Contentof organic acids in the fermentation broth of different strains（mg/mL）

3　結論與討論

從四川麩醋醋醅中篩選到5株高產酸菌株C9-4、C12-4、A30-16、A12-7和A30-14-2均為巴氏醋桿菌。5株菌的產酸特性表明，菌株A30-16對酒精的耐受力最強，可耐受9%（v/v）乙醇，在乙醇含量7%時，產酸量最高為55.51g/L；補加乙醇實驗結果顯示菌株C9-4的產酸量最高（43.60g/L）。底酸濃度適應性實驗結果表明菌株A30-16對底酸的耐受力最強；同時，5株醋酸菌均能產5種以上有機酸。獲得的5株醋酸菌尤其是菌株A30-16和C9-4可作為優(yōu)良菌種用于四川麩醋及其他種類食醋、果醋等發(fā)酵醋產品的釀造。

據余寧華等報道［19-20］，乳酸和酒石酸是以麩醋為代表的保寧醋的特征性有機酸，尤其是乳酸含量明顯高于其他有機酸，成就了保寧醋酸味柔和、酸中回甜的特點；但本文從四川麩醋醋醅中篩選的巴氏醋桿菌的醋酸發(fā)酵液中均未檢出乳酸；結合Shin Haruta等［21］和許瑋等［12］研究結果，可以推測四川麩醋中大量的乳酸可能來源于其醋醅中存在的乳酸菌。

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Screening of high quality acitic acid bacteria from grains of Sichuan bran vinegar and its characteristics of producting acid

SHAO Xiang-li，ZHAO Shuang+，LIU Shu-liang*，LI Jian-long，HU Xin-jie，ZHAO Qin，HE Li，DENG W ei-qin，HAN Xin-feng
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

Five high-yielding acetic acid bacteria（C9-4，C12-4，A30-16，A12-7 and A30-14-2）were screened from Sichuan b ran vinegar g rains，they were all identified as Acetobacter pasteurianus by analysis of morphological，physiological and biochem ical characteristics，and 16S rDNA genetic identification.The results of acid-p roducing characteristics of the 5 high-yield ing strains showed that C9-4，A30-14-2 and A30-16 could adap ted to 9%（v/v）ethanol，allof the 5 strains could stand 4%acid concentration.The results of ethanol addition tests showed that strain C9-4 could transform ethanol to acid continuously most.C9-4，A30-16 and A30-14-2 could stillp roduce acid at40℃.Acid p roducing rates of strains C9-4，A30-16 and A30-14-2 were higher than that of strains C12-4 and A12-7 under the same cond ition.The total amount of organic acids p roduced by the 5 strains were as follows：A30-16＞C12-4＞C9-4＞A30-14-2＞A12-7.

Sichuan bran vinegar；acetic acid bacteria；sc reening；identification；characteristics

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-0203-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.037

2014-07-04+并列第一作者

邵向麗（1990-），女，本科，研究方向：食品科學與工程。趙爽（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

劉書亮（1968-），男，博士，教授，主要從事食品微生物與發(fā)酵方面的研究。

四川省科技廳科技支撐計劃（2013NZ0055）資助。