符宏磊，侯茂霞，孫紫悅，岳利芳，賈士儒，戴玉杰

（天津科技大學生物工程學院，天津300457）

發(fā)菜多糖對小鼠血清中細胞因子及抗氧化能力的影響

符宏磊，侯茂霞，孫紫悅，岳利芳，賈士儒，戴玉杰*

（天津科技大學生物工程學院，天津300457）

研究了野生發(fā)菜多糖（EPSA）和人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖（EPSB）對小鼠血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-12（IL-12）的影響并且測定了谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-PX），過氧化氫酶（CAT），超氧化物岐化酶（SOD），丙二醛（MDA）的活性。實驗表明，EPSA和EPSB對血清中IL-1的含量幾乎沒影響。EPSA高劑量組（100mg/kg·d）和EPSB高劑量組（100mg/kg·d）均能提高小鼠血清中IL-6的含量，其中EPSB高劑量組與空白組比較，差異顯著（p＜0.05）。而且，不同劑量的EPSA和EPSB均極顯著的提高了血清中IL-12的含量（p＜0.01）。此外，在高劑量條件下，EPSA和EPSB與空白組相比，均能顯著性地提高血清中TNF-α含量（p＜0.05）。同時，研究發(fā)現(xiàn)，高劑量（100mg/kg·d）EPSA與低劑量（50mg/kg·d）EPSB的CAT活性均極顯著的高于對照組（p＜0.01）。高劑量（100mg/kg·d）EPSA與對照組相比，可以極顯著的提高小鼠血清中的谷胱甘肽氧化物酶（GSH-PX）的含量（p＜0.01）。兩種多糖對MAD含量影響不顯著（p＞0.05）。EPSA能夠顯著（p＜0.05）提高小鼠血清中SOD的含量，此外，低劑量的EPSB能極顯著（p＜0.01）提高小鼠血清中SOD的的含量。

發(fā)狀念珠藻，多糖，細胞因子，抗氧化

發(fā)菜（發(fā)狀念珠藻，Nostoc flagelliforme），主要分布于北部和西北部的干旱、半干旱地區(qū)。野生發(fā)菜分泌大量多糖在體外形成鞘體、黏液層和莢膜，液體培養(yǎng)條件下發(fā)菜細胞可將多糖分泌到培養(yǎng)液中。研究發(fā)現(xiàn)從野生發(fā)菜中提取的酸性多糖—nostoflan，是一種潛在的抗病毒藥物［1］。同時，發(fā)菜多糖能清除多種自由基［2］，并且具有顯著的抗突變能力［3］。但是由于野生發(fā)菜資源瀕臨枯竭，使發(fā)菜及其多糖應用受到限制。

由于野生發(fā)菜資源瀕臨枯竭，同時滿足其市場需求，研究者們提出了發(fā)菜的液體懸浮培養(yǎng)方法。蘇建宇等［4］從天然藻體中分離出細胞對其進行液體懸浮培養(yǎng)，提高了發(fā)狀念珠藻細胞的生長速度和胞外多糖的產(chǎn)量。同時，為了對比人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖和野生發(fā)菜多糖的區(qū)別，一些學者如賈士儒等［5］研究發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖具有和野生發(fā)菜多糖相近的結(jié)構(gòu)和組成，單糖組成均為葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖；表觀分子量分別為2.79×105、2.26×105，這為研究人工培養(yǎng)發(fā)菜多糖和野生發(fā)菜多糖的功能區(qū)別做了鋪墊。

免疫調(diào)節(jié)作用是多糖最重要的活性作用之一，但發(fā)菜多糖免疫調(diào)節(jié)活性的研究及報道不多。戴玉杰等［6］研究發(fā)現(xiàn)野生發(fā)菜多糖可以提高單核巨噬細胞、腹腔巨噬細胞的吞噬能力并且可以促進T淋巴細胞的增殖。目前，在細胞因子水平上發(fā)菜多糖如何調(diào)節(jié)免疫功能尚不完全清楚，且目前對發(fā)菜多糖體外抗氧化的研究較多，對發(fā)菜多糖體內(nèi)抗氧化的研究較少。本實驗主要從四種免疫細胞因子的角度初步探討了發(fā)菜多糖的免疫調(diào)節(jié)作用機制，并且通過測定GSH-PX、CAT、SOD、MDA的酶活性評價了發(fā)菜多糖的體內(nèi)抗氧化功能。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實驗采用BALB/c小鼠SPF級，雄性，體重為18～20g，購自中國食品藥品檢定研究院，許可證號SCXK（京）2009-0017，飼養(yǎng)在溫度20～25℃，相對濕度50%±5%的動物房內(nèi)，將動物隨機分為3組，每組12只，分別為空白組、發(fā)菜多糖50mg/kg劑量組、發(fā)菜多糖100mg/kg劑量組；IL-1、IL-6、L-12、TNF-γ細胞因子ELISA試劑盒上海研輝生物科技有限公司；CAT檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、GSH-PX檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒上海研輝生物科技有限公司。

150i/240i型 CO2培 養(yǎng) 箱Thermo公 司 ；SPECTRAmax 190型全自動酶標儀美國Molecular Devices公司；UEIP-503實驗型膜過濾裝置天津膜天膜工程技術有限公司；RE3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠；TD5A-WS湘儀離心機湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1發(fā)菜胞外多糖的制備

1.2.1.1野生發(fā)菜胞外多糖的提取［7］將野生發(fā)菜洗凈后，80℃熱水反復浸提4次后，浸提液使用截流分子量為10000u超濾膜濃縮。濃縮液經(jīng)離心（4000r/min，10m in）后得上清液。向上清液中加入4倍體積的無水乙醇，使乙醇含量為80%，4℃過夜，離心取得多糖沉淀，用無水乙醇洗滌沉淀后將沉淀凍干后得野生發(fā)菜胞外多糖［5］，人工命名為EPSA。

1.2.1.2人工培養(yǎng)發(fā)菜胞外多糖的提取發(fā)菜細胞經(jīng)人工液體懸浮培養(yǎng)［8］20d，培養(yǎng)液使用截流分子量為10000u的超濾膜濃縮。濃縮液處理方法同上，沉淀凍干后備用，人工命名為EPSB。

然后分別將濃縮液在4000r/m in下離心10m in得上清液。向上清液中加入4倍體積的無水乙醇，使乙醇體積分數(shù)為80%，4℃過夜，使用sevag法［9］反復除蛋白7次后，將多糖冷凍干燥，最后得到發(fā)菜胞外多糖，使用苯酚-硫酸法測得其多糖含量為73%。

1.2.2細胞因子IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α的測定小鼠給藥結(jié)束后摘眼球取血，于4℃冰箱放置4h，待血清析出后，以3000r/m in離心10m in，收集血清。細胞因子的測定嚴格按照試劑盒說明進行操作，采用SPECTRAmax 190型全自動酶標儀檢測。

1.2.3GSH-PX、CAT、SOD、MDA的測定小鼠給藥結(jié)束后摘眼球取血，于4℃冰箱放置4h，待血清析出后，以3000r/m in離心10m in，收集血清。血清中GSH-PX、CAT、SOD、MDA的測定嚴格按照試劑盒說明進行操作，采用SPECTRAmax 190型全自動酶標儀檢測。

1.2.4數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進行方差分析，用Duncan法進行多重比較，結(jié)果均以±s表示。

2　結(jié)果與分析

2.1EPSA和EPSB對小鼠血清中IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α含量的影響

表1為發(fā)菜多糖對小鼠血清中細胞因子（IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α）濃度的影響。由表1可以看出，與空白組相比，不同劑量的發(fā)菜多糖可以不同程度地提高小鼠血清中細胞因子的含量。結(jié)果如表1所示，EPSA和高劑量組的EPSB可以略微提高血清中IL-1的含量，但沒有顯著性（p＞0.05）。由此推斷，前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)菜多糖對小鼠胸腺指數(shù)和體內(nèi)脾淋巴細胞增殖的影響不明顯［5］，可能與發(fā)菜多糖對血清中IL-1濃度無明顯影響有關。

IL-6由多種細胞產(chǎn)生，如單核細胞在受到LPS刺激時能產(chǎn)生IL-6，在機體發(fā)生炎癥時單核細胞和巨噬細胞能最早產(chǎn)生IL-6，成纖維細胞可自發(fā)產(chǎn)生IL-6。IL-6具有多種生物活性，如刺激多種細胞生長和促進細胞分化，調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長和分化等［10］。實驗結(jié)果表明，與空白組相比，EPSB和EPSA高劑量組（100mg/kg·d）均能提高IL-6的濃度，其中高劑量組的EPSB能顯著性提高小鼠血清中IL-6的含量（p＜0.05）。低劑量組的多糖對IL-6濃度幾乎無影響。

IL-12［11］主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，它能提高NK細胞的殺傷活性和LAK細胞粘附分子的表達，還可以調(diào)節(jié)淋巴細胞的增殖，刺激T細胞和NK細胞產(chǎn)生IFN-γ。灌胃發(fā)菜多糖后，與空白組相比，不同劑量組的EPSB和EPSA均極顯著的提高了小鼠血清中IL-12的含量（p＜0.01）。此外，相同劑量的EPSB比EPSA，小鼠血清中IL-12的水平偏高，高劑量（100mg/kg·d）的EPSB與EPSA相比，IL-12的含量差異極顯著（p＜0.01）。灌胃發(fā)菜多糖后小鼠血清中IL-12含量的提高進一步說明了多糖能夠提高單核巨噬細胞和腹腔巨噬細胞的活性；而小鼠NK細胞活性的增加，可能與小鼠血清中IL-12濃度的提高有一定關系，這與之前的報道結(jié)果一致［6］。

如表1所示，兩種多糖均能有效提高小鼠血清中腫瘤壞死因子TNF-α，并存在劑量依賴性。較空白組，高劑量的EPSA和EPSB均能顯著性提高血清中TNF-α的含量（p＜0.05），并且EPSB對TNF-α的影響更大。腫瘤壞死因子TNF-α主要由單核細胞和巨噬細胞合成產(chǎn)生，它在體內(nèi)及體外都能殺死或抑制某些腫瘤細胞。在體內(nèi)腫瘤壞死因子還可以提高T細胞及其他殺傷細胞對腫瘤細胞的殺傷活性，活化單核細胞和巨噬細胞，調(diào)節(jié)不同細胞的分化，促進T淋巴細胞［12］和B淋巴細胞的增殖。本課題組已有研究結(jié)果表明發(fā)菜多糖在體外能抑制A549人肺癌細胞、BEL-7402人肝癌細胞、Hela細胞的生長［13］。灌胃發(fā)菜多糖后小鼠血清中的腫瘤壞死因子TNF-α濃度增加進一步表明EPSA和EPSB都具有潛在的抗腫瘤的活性。

表1　發(fā)菜多糖對小鼠血清中細胞因子含量的影響（n=6）Table 1　Effectof N.flagelliforme polysaccharides on cytokines in serum ofmice（n=6）

2.2EPSA和EPSB體內(nèi)抗氧化活性研究

CAT、GSH-PX、SOD是機體抗氧化系統(tǒng)中重要的酶類［14-17］。從表2可知，EPSA和EPSB組CAT、SOD活性均高于空白組，其中，高劑量（100mg/kg·d）EPSA與低劑量（50mg/kg·d）EPSB的CAT活性均極顯著的高于空白組（p＜0.01）；低劑量（50mg/kg·d）EPSB和EPSA，相比空白組，均極顯著（p＜0.01）和顯著（p＜0.05）的提高SOD活性，從而減少超氧陰離子對機體的傷害。高劑量（100mg/kg·d）EPSA與空白組相比，極顯著提高了GSHPX活力。從表2還可以看出隨著EPSB濃度的升高，CAT、GSH-PX、SOD三種酶的活性降低。而相反，隨著EPSA濃度的升高，CAT、GSH-PX、SOD三種酶的活性升高，存在劑量依賴效應。表2中，多糖組的MDA濃度較空白組略高，但沒表現(xiàn)出顯著性差異。綜合分析可知，在抗氧化功能方面，低劑量（50mg/kg·d）EPSB的作用明顯優(yōu)于高劑量（100mg/kg·d）EPSB，而高劑量（100mg/kg·d）EPSA的作用明顯優(yōu)于低劑量（50mg/kg·d）EPSA。

表2　發(fā)菜多糖對小鼠血清中CAT、GSH-PX、MDA、SOD的影響（n=6）Table 2　Effectof N.flaggelliforme on the concentration of CAT，GSH-PX，MDA and SOD in serum ofmice（n=6）

3　結(jié)論

白細胞介素在機體免疫應答過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。IL-12作為一種細胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子對腫瘤有直接對抗作用，在原發(fā)性、繼發(fā)性腫瘤的免疫反應中起重要作用［18-19］。TNF-α是一種多功能細胞因子，具有直接抗腫瘤作用的細胞因子。本文研究結(jié)果表明，不同劑量組的EPSB和EPSA均極顯著（p＜0.01）的提高了小鼠血清中IL-12的含量，高劑量的EPSA和EPSB均能顯著性提高血清中腫瘤壞死細胞因子TNF-α的含量（p＜0.05），這可能是發(fā)菜多糖抗腫瘤的原因之一。

陳雪峰等［20］通過自由基清除實驗對發(fā)菜多糖的體外抗氧化活性進行了測定，發(fā)現(xiàn)發(fā)菜多糖有很強的清除羥自由基和超氧陰離子自由基的作用。但是，由于在生命體中，有更多的生物分子比多糖更易受到攻擊，故多糖體內(nèi)抗氧化和體外抗氧化的機制可能不同。本研究以檢測CAT、GSH-PX、SOD和MDA為指標來評價體內(nèi)抗氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)，高劑量（100mg/kg·d）EPSA與低劑量（50mg/kg·d）EPSB分別極顯著（p＜0.01）和顯著（p＜0.05）提高了CAT和SOD活性，表明發(fā)菜多糖可以通過增強體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化作用。至于發(fā)菜多糖的免疫調(diào)節(jié)作用與抗氧化作用之間是否存在關聯(lián)、存在怎樣的作用機制，是今后研究的重點。

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Effect of extracellular polysaccharides from Nostoc flagelliforme on the levelof cytokine and antioxitation capacity ofm ice serum

FU Hong-lei，HOU Mao-Xia，SUN Zi-yue，YUE Li-fang，JIA Shi-ru，DAIYu-jie*
（College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

The effects of polysaccharides from liquid-cultured Nostoc flagelliforme（EPSA）and w ild Nostoc flagelliforme（EPSB）on the level of cytokine（TNF-α，IL-1，IL-6，IL-12）and the contents of GSH-PX，CAT，SOD，MDA of BALB/c Mice were investigated.Evidences indicated that the serum level of IL-6 was raised by high dose of EPSA（100mg/kg·d）and EPSB（100mg/kg·d）and the serum level of IL-6 was significantly（p＜0.05）raised by high dose of EPSB（100mg/kg·d）.Meanwhile，IL-12 was extrem ly enhanced（p＜0.01）by different concentrations of EPSA and EPSB com pared w ith the control.Morever，the level of TNF-αwas remarkab ly inc reased（p＜0.05）by high dose of EPSA（100mg/kg·d）and EPSB（100mg/kg·d）.The content of CAT was enhanced（p＜0.01）by high dose of EPSA（100mg/kg·d）or low dose of EPSB（50mg/kg·d）.The content of GSH-PX was significantly enhanced（p＜0.01）by high dose of EPSA（100mg/kg·d）.The content of MDA was slightly enhanced by EPSA and EPSB w ith no significance（p＞0.05）.Besides，the content of SOD was significantly enhanced（p＜0.05）by EPSA and extrem ly enhanced（p＜0.01）by low dose of EPSB（50mg/kg·d）.

Nostoc flagelliforme；polysaccharides；cytokine；antioxitation func tion

TS201.4

A

1002-0306（2015）06-0351-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.068

2014-07-30

符宏磊（1988-），女，碩士研究生，研究方向：生物分離工程、微藻培養(yǎng)。

戴玉杰（1965-），男，博士，教授，研究方向：生物分離工程、微藻培養(yǎng)及藥物設計與合成。

國家自然科學基金資助項目（31271809）。