黃潤庭，李宗軍，2，*，伍　婧

（1.湖南農業(yè)大學食品科學技術學院，湖南長沙410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

幾種常見微生物降膽固醇機制探討

黃潤庭1，李宗軍1，2，*，伍婧1

（1.湖南農業(yè)大學食品科學技術學院，湖南長沙410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

高膽固醇血癥是引起動脈粥樣硬化等嚴重疾病的潛在危險因素，對于降膽固醇方法的研究也成為了醫(yī)學和食品界的研究熱點。用微生物降膽固醇的方法具有成本低、效率高等優(yōu)點，本文主要介紹乳酸菌、酵母菌、紅曲霉等幾種常見具有降膽固醇能力的微生物及其降膽固醇作用機制。

降膽固醇，微生物，作用機制

當今社會發(fā)展速度快，人們生活水平有了很大提高，而一些慢性病也悄然走進了現代人的生活中。膳食結構對人們身體健康有很大影響，而高脂肪、高熱量的現代人膳食結構使得血脂異?；颊哂辛孙@著增多。2002年，由衛(wèi)生部開展的關于中國居民營養(yǎng)狀況的調查在全國范圍內進行，結果發(fā)現：在我國，成年人高血壓的患病率為18.8%，成年人血脂異常的患病率為18.6%［1］。2012年，研究人員對中國75個城市監(jiān)測點的居民進行了營養(yǎng)與健康狀況調查，結果發(fā)現大城市居民的高膽固醇血癥患率增至12.8%，高甘油三酯癥的患病率增至26.6%［2］。人體血脂異常會引起如高血脂癥、高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等一系列慢性心血管疾病。其中血漿膽固醇特別是低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量過高則是引起動脈粥樣硬化等一系列心血管疾病的主要危險因素［3］。因此，尋求一種有效可行的降膽固醇方法正是很多科研工作者所奮斗的目標。

在生物體內，膽固醇來源分為外源性膽固醇（約占1/3）以及內源性膽固醇（約占2/3）兩種。降低膽固醇的方法主要為：脫除食物中膽固醇，從而得到低膽固醇含量食品以及抑制膽固醇體內合成這兩種方法。20世紀70年代國外就有研究發(fā)現腸道微生物在豬體內具有降膽固醇作用［4］。隨之對微生物降膽固醇作用有了廣泛研究并發(fā)現微生物降膽固醇方法具有效率高、成本低，還能為食品帶來優(yōu)良風味等特點，因此研究開發(fā)利用微生物降膽固醇的方法備受關注。

具有降膽固醇能力的微生物種類較多，其作用機制也有所差異。本文將對幾種常見的具有降膽固醇能力微生物的作用機制進行探究，希望有利于為以后更深入的研究提供參考。

1　與食品有關的降膽固醇的微生物及其作用機理

1.1降膽固醇乳酸菌的多樣性及其機制

乳酸菌大量存在于發(fā)酵制品中，并能夠為發(fā)酵制品提供良好風味，提高其營養(yǎng)物質含量、增強其保健作用以及延長產品貨架期等功能。乳酸菌對人體還能起到很好的調節(jié)胃腸道功能、降膽固醇、調節(jié)血脂、增強免疫力等益生功能［5］。在乳酸菌降膽固醇作用及其作用機理方面人們有了廣泛的研究并發(fā)現很多乳酸菌對食品及含膽固醇培養(yǎng)基具有脫除膽固醇的作用（見表1）。

表1　具有降膽固醇作用的乳酸菌菌株Table 1　Strain of lowing cholesterol lactic acid bacteria

乳酸菌降膽固醇作用機制主要有三種觀點：膽固醇共沉淀作用、乳酸菌對膽固醇同化吸收作用以及共沉淀和吸收共同作用降膽固醇。

1.1.1乳酸菌對膽固醇的共沉淀作用膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）是微生物在生長，繁殖過程中產生的一種代謝物；主要由乳酸菌產生，能特異地水解結合態(tài)膽酸鹽中的酰胺鍵（見圖1），并將其轉變成氨基酸以及游離膽酸［13］。體外實驗發(fā)現，在含有一定濃度膽鹽的高膽固醇培養(yǎng)基中，乳酸菌產生的膽鹽水解酶能夠催化水解結合膽鹽，使得結合膽鹽水解為游離膽酸，在酸性（pH＜6.0）條件下，游離膽酸溶解度下降且其共軛活性增強，繼而與膽固醇形成沉淀，從而降低了培養(yǎng)基中膽固醇含量［14］。

圖1　膽鹽水解酶水解?；悄懰猁}示意圖Fig.1　Themechanism of BSH hydrolyzes taurocholate

在膽固醇共沉淀作用中，膽鹽水解酶起著重要作用。因此探討膽鹽水解酶作用最優(yōu)條件以及尋求更高活性的膽鹽水解酶成為了膽固醇共沉淀研究方向中的一個熱點。膽鹽水解酶在解離膽鹽時對不同膽鹽的水解能力表現出一定的選擇性。相比?；悄懰猁}，膽鹽水解酶對于甘氨膽酸鹽具有更強的解離能力，因此由甘氨膽酸鹽解離出來的游離膽酸能夠更多地和膽固醇結合并形成沉淀；而對于模擬人體膽鹽比例的組合膽鹽其水解能力不如單純甘氨膽酸鹽強［15］。在pH為5.2時，膽鹽水解酶活性最高，厭氧狀態(tài)下，膽固醇共沉淀去除率要比有氧條件下高；膽固醇存在形式對于膽鹽水解酶的產生有很大的影響，對于只有水溶性膽固醇存在的條件下，即使在較低pH環(huán)境也不能發(fā)生共沉淀作用［16］。李秀涼等［17］，通過響應面分析法發(fā)現葡萄糖、蛋白胨和無水乙酸鈉是影響植物乳桿菌產膽鹽水解酶的主要影響因素，研究人員對發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，發(fā)現在最優(yōu)培養(yǎng)基組成中，植物乳桿菌發(fā)酵產生的膽鹽水解酶的產量為單因素實驗的6.4倍。

不同乳酸菌產生膽鹽水解酶受不同核苷酸序列編碼，有的菌株可能存在多個編碼基因序列。隨著分子技術的發(fā)展，乳酸菌編碼膽鹽水解酶的基因逐漸被發(fā)現。了解編碼膽鹽水解酶的基因序列信息（見表2）有利于利用分子技術對相應基因作出調控，從而能夠深入了解膽鹽水解酶合成機理或提高其活性。楊士芹等［18］，通過基因重組技術將兩雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的膽鹽水解酶基因片段重組到大腸桿菌中表達并具有較高酶活性，這一研究為日后探究高活性高產膽鹽水解酶的生產提供了參考基礎。

表2　乳酸菌膽鹽水解酶的基因序列信息Table 2　Gene sequence of bile salthydrolase

體外乳酸菌通過共沉淀去除膽固醇的作用已被國內外大量實驗所證實，然而，在體內能否起到相同作用其機理如今仍不太明晰。有人提出對體內膽固醇共沉淀作用機理的猜測，認為在腸道中乳酸菌為了降低膽鹽對自身的危害而通過產生膽鹽水解酶將膽鹽水解為游離膽酸；游離膽酸不能被腸道重吸收而隨糞便排出，因此減少了膽酸在消化系統(tǒng)中的循環(huán)次數，從而增加了膽酸的生物合成；而膽固醇又是形成膽酸的前體物質，所以為了彌補膽酸的損失而加速了膽固醇的消耗代謝［22］。然而，雖然游離膽酸不被人體吸收，但是如果游離膽酸沒能及時排出體外而在大腸中被其他微生物降解為次生膽鹽則會對人體產生致癌的風險。因此對于共沉淀作用在體內的機理以及產物毒理學和去向的研究仍需要更多的動物實驗作進一步的驗證。

1.1.2乳酸菌對膽固醇的吸收作用20世紀80年代S E GILLILAND等［23］發(fā)現，在體外乳酸菌能通過吸收作用去除培養(yǎng)基中的膽固醇。乳酸菌吸收膽固醇的主要機理是膽固醇進入細胞膜并與磷脂雙分子層進行疏水結合，進而起到了吸收環(huán)境中膽固醇的作用。由體外乳酸菌吸收膽固醇實驗發(fā)現，將乳酸菌放置于高膽固醇MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，鏡檢發(fā)現乳酸菌細胞膜疏水部分結合了大量膽固醇；再將吸收了大量膽固醇的乳酸菌細胞轉接到新鮮MRS培養(yǎng)基上，經過培養(yǎng)發(fā)現細胞膜中膽固醇含量降低，而培養(yǎng)基中膽固醇含量則增加，增加量恰好是細胞膜中膽固醇的下降量，由此可知吸收膽固醇作用并非乳酸菌代謝作用的結果［24］。Huey-Shi Lye等［7］通過比較多株乳酸菌吸收清除膽固醇能力的實驗發(fā)現干酪乳桿菌L.casei ATCC 393清除膽固醇能力較強，還發(fā)現吸收了膽固醇的乳酸菌細胞對于超聲波處理較普通乳酸菌細胞有較強的抵抗能力，并通過掃描電鏡直觀地看出吸收了膽固醇的乳酸菌表面較對照組更粗糙不平。可見膽固醇在細胞膜中并非均勻分布，又由于膽固醇富集于細胞膜中，從而大大地降低了細胞膜的通透性，因此導致細胞對超聲波有較強的抵抗力。

乳酸菌需要在有膽鹽存在的情況下才能起到同化膽固醇的作用，反之則不起作用。適宜的膽鹽濃度能夠使得乳酸菌細胞壁通透性增強，從而有利于膽固醇穿過細胞壁并與細胞膜磷脂層進行疏水結合；然而，膽鹽濃度過高，則可能破壞細菌細胞壁，從而破壞了細胞結構最后導致乳酸菌死亡。同時，細胞壁上肽聚糖的特性影響著膽固醇的吸附特性，這與其中氨基酸種類有關［25］。乳酸菌對膽固醇吸收作用還受到乳酸菌的種類、乳酸菌生長情況、接種量、膽固醇存在形式、膽鹽種類、pH條件以及是否為厭氧環(huán)境培養(yǎng)等因素影響。綜合國內外資料發(fā)現：在一定時間范圍內，乳酸菌對培養(yǎng)基中膽固醇吸收程度和時間成正比，整體吸收趨勢與乳酸菌生長周期趨勢一致，并發(fā)現活細胞降膽固醇活性最強，休眠細胞次之，死細胞相對最弱。對于這一現象可以解釋為：隨著乳酸菌生長周期的推移，其細胞壁通透性下降，細胞膜疏水結合膽固醇能力也隨之下降。不同菌株對膽鹽的選擇性不一致，這也許跟其本身合成酶活性以及細胞壁中氨基酸種類有關。

1.1.3乳酸菌通過共沉淀和吸收相互作用降膽固醇

隨著對乳酸菌降膽固醇作用及其機制的深入研究，人們發(fā)現在實踐中，乳酸菌降膽固醇并不只是一種機制起作用，而更多是吸收和共沉淀作用相互協(xié)調的結果，而且在一定條件下會表現出以其中一種方式為主導的作用形式。田建軍等［26］在篩選能高效降低膽固醇乳酸菌的實驗中發(fā)現，其體外降膽固醇機制是以共沉淀作用為主同化作用輔助的協(xié)同機制進行的。FRANK A M KLAVER等［27］對乳酸桿菌以及兩雙歧桿菌體外降膽固醇機制的探究實驗發(fā)現80%為共沉淀作用，20%為同化作用，共同降低膽固醇。于平等［28］實驗篩選植物乳桿菌也發(fā)現兩株具有降膽固醇能力的菌株其作用除了有共沉淀和同化共同協(xié)調作用外，還能通過產生特殊酶對膽固醇進行轉化。

乳酸菌在體內降膽固醇作用也得到了很多動物實驗的證實。動物實驗還發(fā)現，向高血脂膽固醇小鼠飼料中添加乳酸菌，除了血漿總膽固醇以及總甘油三酯水平下降外，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量下降，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的含量卻有所增加［29］。高密度脂蛋白膽固醇能夠將血漿中的膽固醇運往肝臟細胞，從而促進膽固醇的代謝減少血漿中的含量；而低密度脂蛋白作用則相反，能夠提高血漿中膽固醇含量。乳酸菌還能夠抑制膽固醇形成膠束形式，進而能夠減少膽固醇被小腸吸收，而且能夠促進膽固醇共沉淀的作用。乳酸菌要在體內發(fā)揮降膽固醇作用，需要具有一定的抗胃腸道逆環(huán)境的能力所以對于其耐酸以及耐膽鹽能力也有一定的要求。然而，具有降膽固醇益生功能的乳酸菌不一定具有很好的抗胃腸道逆環(huán)境的能力，因此將具有降膽固醇能力的益生菌制成制劑則是一個很好的選擇。將具有高抗胃腸道逆環(huán)境能力的菌與具有降膽固醇益生作用菌制成混合菌制劑，可以減少益生菌在胃腸道中受到損失，提高其存活率；多層包埋微膠囊技術也能夠增強益生菌抗胃腸道逆環(huán)境能力，并能夠定點釋放乳酸菌，達到增強其在腸道發(fā)揮預期作用的效果。

1.2酵母菌降膽固醇作用

酵母菌是被人類應用歷史較長的微生物，酵母菌在自然界廣泛分布。在食品行業(yè)中，酵母菌被廣泛應用于酒類釀造、面包制作等方面。有研究發(fā)現，從藏靈菇分離出的酵母具有較強的抗胃腸道逆環(huán)境能力以及降膽固醇的作用［30］，從藏靈菇分離出來的酵母與乳酸菌混合發(fā)酵的蛋乳飲料，發(fā)現其中膽固醇含量比乳酸菌單獨一次發(fā)酵的還要低39%［31］，因而可以制得膽固醇含量更低，而其他營養(yǎng)成分含量不變的功能性食品。

圖2　馬克思克魯維酵母體內降膽固醇作用Fig.2　The progress of the reduction of cholesterol in vivo by Kluyveromycesmarxianus

酵母菌降膽固醇作用機制根據菌株的不同而異，主要分為產生膽鹽水解酶發(fā)生的共沉淀作用以及細胞壁膳食纖維對膽固醇的吸收作用兩種機制。從藏靈菇分離出來的克魯維酵母主要通過產生膽鹽水解酶使得膽固醇發(fā)生共沉淀的作用，從而降低了膽固醇［32］。馬克思克魯維酵母由于富含膳食纖維的細胞壁對膽固醇進行吸附作用，從而降低了用高膽固醇飼料喂養(yǎng)的小鼠的血漿膽固醇含量［33］。膳食纖維主要通過對膽固醇的吸附作用，從而使膽固醇不能被腸道吸收，并隨糞便排出體外。還有實驗發(fā)現馬克思克魯維酵母還能促進實驗小鼠結腸產生大量短鏈脂肪酸［34］，這與馬克思克魯維酵母細胞壁含有大量膳食纖維有關。由于膳食纖維在小腸內不被吸收，進入大腸后被細菌發(fā)酵產生短鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸中的丙酸能夠影響膽固醇合成限速酶（HMG-Co A還原酶）活性，能夠有效地抑制肝臟膽固醇的合成，短鏈脂肪酸還能與膽固醇競爭小腸吸收位點，進而可以進一步降低血漿總膽固醇的含量（見圖2）［35］。

酵母由于富含B族維生素，而且蛋白質含量高，已經被制作成酵母片等促進消化的保健品。然而，針對于酵母菌降膽固醇功能制作的保健產品市面上仍然比較少。研究發(fā)現具有降膽固醇能力的酵母其抗胃腸道環(huán)境能力也比較強，因此，針對這一特性開發(fā)相應的降膽固醇酵母產品將具有寬廣的發(fā)展前景。

1.3紅曲霉降膽固醇作用

紅曲霉在國內外通常應用于釀酒、制醋、發(fā)酵肉等方面。由于其發(fā)酵時可產生大量的紅色素——紅曲色素，因此紅曲色素經常作為一種天然染色劑使用。隨著對紅曲霉研究的深入，人們發(fā)現紅曲霉能發(fā)酵產生具有降膽固醇作用的代謝物——莫納可林K（Monacolin K），隨后又相繼發(fā)現了和莫納可林K結構相似的莫納可林J、L、M等活性物質［36］。如今，莫納可林K已經被制造成一種常見的降膽固醇藥物弗洛他汀。莫納可林K（見圖3）分為酸式和內酯式，酸式莫納可林K具有一個與膽固醇合成過程中限速酶3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-Co A還原酶）相似的羥基基團，能與該酶的COOR末端相互作用，能夠和HMG-Co A還原酶底物發(fā)生競爭作用，因此可以有效抑制該酶活性，從而抑制了膽固醇的體內合成［37］。

圖3　紅曲霉產生降膽固醇物質的分子結構Fig.3　The structural formula of the lowing cholesterol substance produced bymonascus

然而，紅曲霉發(fā)酵產生莫納可林K的同時也會產生有毒物質桔霉素。桔霉素主要損害腎臟，并具有致腫瘤、致突變、致畸等危害性；據研究發(fā)現小鼠的經口半致死量為110mg/kg［38］。然而，紅曲色素中還含有豐富的黃酮、麥角甾醇和不飽和脂肪酸等物質，這些物質同樣具有很好的調節(jié)血脂的作用；而僅將莫納可林K分離出來單獨作用也許不如多種物質協(xié)同作用的效果好。因此對于具有高效降膽固醇能力而使用劑量低的紅曲霉的開發(fā)以及探究降低桔霉素產量的發(fā)酵條件工藝優(yōu)化這兩方面研究備受科學研究者的關注。

Lee Chun-Lin等［39］通過與添加弗洛他汀組對比發(fā)現只需10.78mg/100g劑量的M.purpureus NTU568喂養(yǎng)高血脂倉鼠即可獲得理想的降膽固醇的效果，同時低劑量紅曲霉所產生桔霉素的含量也比較少，推廣至人體也未能造成危害。有研究發(fā)現，在35℃條件下，將16株紅曲霉菌接種到土豆葡萄糖培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)8d，只有4株菌產桔霉素且含量在3～21mg/L之間，含氮量高的培養(yǎng)基桔霉素產量也增加［40］。由此可見桔霉素的合成不僅與菌株有關，而且與培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成以及培養(yǎng)環(huán)境條件也有關系。對于控制桔霉素產量以減少其對人體的危害的探究，有利于人們更好地利用紅曲霉。

2　微生物產生轉化膽固醇的酶作用

除了以上綜述的常見具有降膽固醇能力微生物外，還有很多微生物通過產生一些特殊的酶轉化膽固醇（見表3），使之從食物中脫除或者轉化成不被人體吸收的物質。

研究表明膽固醇氧化酶（Cholesterol oxidase，COD）可以催化膽固醇氧化以及異構化反應，生成膽甾-4-烯-3-酮和過氧化氫，并發(fā)現膽甾-4-烯-3-酮具有降血脂的功效［48］。通過對膽固醇氧化酶特性及其基因信息的了解（見表4），人們可以更好地利用膽固醇氧化酶，例如通過調節(jié)作用條件提高酶活性，或者利用基因工程等技術獲得高活性膽固醇氧化酶以及高產量菌株，也是對于膽固醇氧化酶方面研究的熱點。由微生物代謝得到的膽固醇氧化酶具有一定的安全性，而且通過膽固醇氧化酶作用于膽固醇后得到的產物具有降血脂作用，因此微生物產膽固醇氧化酶也得到了更多的研究。

表3　產轉化膽固醇酶的微生物Table 3　Producing cholesterol invertasemicroorganism

通過膽固醇還原酶（Cholesterol reductase）作用將膽固醇還原轉化為不能被胃腸道吸收的糞甾醇，也是降膽固醇的一種方法，研究發(fā)現大多數產膽固醇還原酶的微生物存在于大腸菌群中［49］。

表4　部分膽固醇氧化酶基因序列及其特性信息Table 4　Gene sequence and properties of some cholesterol oxidase

3　降膽固醇微生物開發(fā)利用前景

微生物降膽固醇作用在近年來得到了大量體外實驗以及動物實驗的驗證，微生物降膽固醇方法具有應用價值高、成本低、安全等特點，受到很多研究者的關注。對于微生物降膽固醇應用投入企業(yè)生產中，也成為了很多企業(yè)的新項目。

因此對于微生物降膽固醇作用的各個方面應進行更深入的研究，主要為：

a.優(yōu)化微生物產降膽固醇物質的發(fā)酵條件。通過優(yōu)化微生物產降膽固醇物質的發(fā)酵條件，促進降膽固醇代謝物的產生，以便提取應用。例如：通過優(yōu)化發(fā)酵條件，使得莫納可林K、膽鹽水解酶等代謝物更多的產生。

b.加強對微生物產生的具有降膽固醇功能代謝物的作用機理、作用條件以及作用產物毒性的研究，從而達到充分利用微生物降膽固醇代謝物的目的。

c.利用代謝組學分析方法，分析微生物在發(fā)酵過程中所產生的代謝產物及其作用，進而發(fā)現更多具有降膽固醇作用的微生物代謝物質。

d.探究酶作用轉化膽固醇后產物對人體的毒性作用及其去向。如結合膽鹽經膽鹽水解酶作用后的解離膽鹽在體內去向，以及降低次生膽鹽轉化率的方法也仍需進一步的探究；又如，對膽固醇經過膽鹽氧化酶轉化產物的降血脂作用及其回收利用進行開發(fā)等。

e.通過基因工程等生物工程手段對具有降膽固醇作用的微生物進行基因改良，以得到具有更高效更穩(wěn)定的降膽固醇作用的菌株?；蚬こ炭梢杂羞x擇性地讓目標基因得到表達，因此可以通過對編碼微生物降膽固醇能力有關基因進行選擇，通過基因重組技術制得具有更高降膽固醇能力的微生物。

f.結合新的分子生物技術發(fā)現更多具有降膽固醇的微生物，以及對其作用機制進行探究。例如，通過分子工具對微生物進行鑒定以及對基因序列進行研究，進而更深入掌握微生物降膽固醇的機制［50］。

g.對于具有降膽固醇益生功能的微生物安全性進行深入研究，確保對其利用不會對人體或動物體造成危險。

h.將微生物降膽固醇作用與藥物治療結合起來，通過微生物的協(xié)調作用來減輕藥物作用對身體的損害。

微生物降膽固醇是一個備受關注的研究領域，具有很好的前景，因此開發(fā)更多降膽固醇微生物研究將為人類健康做出巨大貢獻。

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Research progress in the mechanism s of lowering cholesterolof several common kinds ofm icroorganism s

HUANG Run-ting1，LIZong-jun1，2，*，WU Jing1
（1.College of Food Science and Technology Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha 410128，China）

Hypercholesterolem ia was the potential risk factors that could lead to some serious diseases like atherosc lerosis.Researches about the method to reduce cholesterolbecome a focus in the field ofmedicaland food.There are many advantages such as costing lower p rice and efficiency by using m ic roorganisms to lower cholesterol.This study would introduce several kinds of common m icroorganisms that had the ability of low ing cholesterol，such as，lac tic acid bacteria，yeast，monascus，etc and the mechanisms of low ing cholesterol.

low ing cholesterol；m ic roorganism s；mechanism s

TS201.3

A

1002-0306（2015）06-0385-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.075

2014-04-28

黃潤庭（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

李宗軍（1968-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技術。