何向明 黃潤 俞洋 向華 楊紅健 宗祥云★

·論著·

CDK2-AP1通過調(diào)控細胞周期抑制乳腺癌生長

何向明 黃潤 俞洋 向華 楊紅健 宗祥云★

目的 探討CDK2-AP1在乳腺癌的作用及其機制。方法 分別在正常乳腺組織及不同分期乳腺癌組織中檢測CDK2-AP1的表達情況；進行CDK2-AP1的LOF & GOF細胞功能實驗；接種CDK2-AP1干擾或過表達的乳腺癌細胞及對照細胞在裸鼠觀察成瘤及相應指標。結果 在乳腺癌存在CDK2-AP1表達降低/缺失而CDK2/CyclinD1表達升高的情況，且CDK2-AP1的表達在正常乳腺組織細胞、乳腺導管原位癌、侵襲性乳腺癌、復發(fā)轉移性乳腺癌漸次降低（P＜0.001），與CDK2/CyclinD1相反。體內(nèi)、外實驗均發(fā)現(xiàn)抑制CDK2-AP1表達后乳腺癌細胞周期后移、增殖加快；過表達CDK2-AP1的乳腺癌細胞周期阻滯在G0/G1和G2/M期，生長受抑制、裸鼠成瘤速度及大小均受抑制。結論 CDK2-AP1的表達降低以至缺失促進乳腺細胞進入惡性增殖形成腫瘤，缺乏細胞周期負性調(diào)控的乳腺癌細胞增殖能力增強。

乳腺癌 CDK2-AP1 細胞周期

細胞周期激酶2相關蛋白1（CDK2-AP1）是CDK2基因的特異性負向調(diào)節(jié)蛋白，文獻報道其表達降低引起TGF-β-Smad 信號通路失活，導致細胞惡性增殖。且在化療藥物介導的DNA損傷過程中通過調(diào)節(jié)CDK2的活性影響腫瘤細胞凋亡［1～5］。CDK2-AP1表達降低還可能與口腔鱗癌、胃癌、食管癌以及前列腺癌的生長、預后有關［6～8］。CDK2-AP1基因在乳腺癌的作用很少報道，本文探討CDK2-AP1與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關系。

1　材料和方法

1.1組織標本檢測 隨機抽取浙江省腫瘤醫(yī)院組織庫標本209例，其中正常乳腺組織40例、乳腺導管原位癌30例、浸潤性導管癌121例、復發(fā)轉移性乳腺癌18例。石蠟切片脫蠟、脫水后免疫組化檢測CDK2-AP1表達。染色強度分兩組：陽性：＞20%腫瘤細胞染色。陰性：≤20%腫瘤細胞染色。

1.2方法 （1）質(zhì)粒構建：CDK2-AP1全長cDNA由人腦組織PCR擴增獲得，通過連接酶反應直接連入酶切后的慢病毒表達載體CMV啟動子下游，基因測序選出重組CDK2-AP1基因表達序列正確的載體。CDK2-AP1上、下游擴增引物分別為5'-AGCATGGCAACGTCTTCACAGT-3'、5'-TGGCATTCCGTTCCGTTTCT-3'；CDK2-AP1特異性siRNA序列為5'-GCTGCTGGCCATCATTGAAGA-3'，對照片段序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。siRNA寡核苷酸退火后連接到pLV3載體生成CDK2-AP1 shRNA和對照shRNA表達質(zhì)粒。（2）病毒包裝 用Qiagen公司質(zhì)粒抽提試劑盒提取慢病毒包裝系統(tǒng)中CDK2-AP1干擾質(zhì)粒、過表達質(zhì)粒和慢病毒輔助質(zhì)粒。使用MISSION Lentiviral Packaging Mix kit （Sigma）按操作步驟將重組質(zhì)粒、包裝載體pGag/Pol、pRev和封裝載體pVSV-G共轉染至HEK293T。將CDK2-AP1慢病毒按感染復數(shù)（MOI）為20，感染6孔板中SK-BR-3細胞獲得穩(wěn)定過表達；同樣siCDK2-AP1慢病毒感染MCF-7獲得穩(wěn)定沉默。感染96h后抽提細胞總RNA和蛋白。（3） Realtime RT-PCR：CDK2-AP1擴增引物見上述，內(nèi)對照GAPDH引物為5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'和5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。兩步法行實時熒光定量，40個循環(huán)中每次在延伸階段讀取吸光度值；PCR結束后，95℃變性lmin，冷卻至55℃，從55℃開始升溫至95℃，每一步保持在＜30s上升0.5℃，同時讀取吸光度值，繪制熔解曲線。（4）Western blot：取30μg等量蛋白加至12% SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴、90V恒壓條件下電轉120min。轉好的膜加一抗4℃孵育12h，洗膜3次，用封閉液稀釋相應的辣根過氧化物酶共價二抗室溫孵育2h，TBST洗膜3次。ECL Western試劑盒（Amersham）顯色。（5）MTT assay：轉染后乳腺癌細胞培養(yǎng)3d后1×103/孔接種于96孔板，44h后加MTT溶液（5mg/ml）37℃培育4h，棄培養(yǎng)介質(zhì)，每孔加100μl DMSO室溫振蕩使充分溶解，檢測540nm波長處吸光度值繪制細胞生長曲線。（6）克隆形成實驗：轉染后乳腺癌細胞對數(shù)生長期胰酶消化、完全培養(yǎng)基重懸。800個/孔接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至每個克隆包含＞50個細胞。PBS洗滌細胞2次，多聚甲醛固定后PBS洗滌2次，Giemsa染色，去離子水洗滌3次后計數(shù)克隆。（7）細胞周期：轉染后乳腺癌細胞1×106/孔接種于12孔板，培養(yǎng)24h后胰酶消化、收集細胞，1500r/min離心5min；1ml預冷PBS洗滌細胞1次，轉移至1.5ml離心管，4℃、1500r/min離心5min，50μl預冷PBS重懸并吹散成單細胞懸液，逐滴加入預冷的950μl 70%乙醇中置-20℃ 3h。加入1U DNase-free RNase，37℃孵育30min，1500r/min離心5min，棄上清液，每管加入500μl PI染色液，37℃避光孵育1h，流式細胞儀檢測細胞周期分布。（8）裸鼠成瘤實驗：CDK2-AP1過表達的SK-BR-3細胞和CDK2-AP1干擾后MCF-7細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，胰酶消化、PBS重懸，100μl細胞懸液（1×107/mouse）皮下注射于雌性裸鼠（BALB/c-nu/nu）［n=54，（20±2）g，4～5周齡］。每3d測量腫瘤大小，記錄長徑和垂直短徑，以公式V （mm3）=1/2ab2計算體積。5周后處死裸鼠，取瘤稱重。腫瘤組織切片免疫組化檢測CDK2/ CyclinD1并計算bcl-2/bax比值。

1.3統(tǒng)計學分析 CDK2-AP1表達差異通過卡方檢驗分析、腫瘤體積和重量差異運用重復測量數(shù)據(jù)的線性回歸分析檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1CDK2-AP1蛋白表達在正常乳腺組織高于乳腺癌組織 免疫組化染色結果顯示CDK2-AP1陽性表達率在正常乳腺組織（72.5%）、導管原位癌（16.7%）、侵襲性乳腺癌（14.0%）、復發(fā)轉移性乳腺癌（5.6%）依次降低（P＜0.001）；CDK2及CyclinD1在正常乳腺組織（7.5%、12.5%）、乳腺導管原位癌（40.0%、50.0%）、侵襲性乳腺癌（51.2%、55.4%）、復發(fā)轉移性乳腺癌（55.6%、50.0%）的表達依次升高（P＜0.001）。不同組織中CDK2-AP1的表達差異提示正常乳腺到癌變以至發(fā)生侵襲、轉移的過程中CDK2-AP1表達降低、功能受抑制并與CDK2/CyclinD1反相關。

2.2CDK2-AP1mRNA可在MCF-7細胞成功沉默、在SK-BR-3細胞成功過表達 MCF-7細胞內(nèi)源性CDK2-AP1的mRNA和蛋白表達水平均較高，SKBR-3細胞則均較低；MDA-MB-231則是mRNA水平較高而蛋白偏低。故以慢病毒介導的CDK2-AP1 siRNA靜默MCF-7細胞的CDK2-AP1表達（見圖1），轉染過表達CDK2-AP1mRNA于SK-BR-3細胞（見圖2）。

2.3CDK2-AP1抑制乳腺癌細胞生長、阻滯細胞于G0/ G1和G2/M期 MTT和克隆形成實驗均顯示CDK2-AP1mRNA靜默的MCF-7細胞生長加速而過表達CDK2-AP1mRNA的SK-BR-3細胞生長受抑制；過表達CDK2-AP1的SK-BR-3細胞G0/G1及G2/M期比例增多、S期比例降低（P＜0.05），siCDK2-AP1轉染的MCF-7 G0/G1及G2/M期比例降低、S期比例升高（見圖3）。

2.4CDK2-AP1靜默促進MCF-7細胞在裸鼠成瘤和生長 siCDK2-AP1轉染MCF-7細胞及對照細胞分別皮下注射于裸鼠，生長5周，發(fā)現(xiàn)CDK2-AP1干擾后促進MCF-7細胞在裸鼠成瘤且生長迅速，腫瘤體積及質(zhì)量均大于對照組（見圖4A、B）。免疫組化顯示CDK2-AP1抑制后bcl 2/bax比值升高，CDK2/ cyclinD1表達升高（見圖4C）。

圖1　CDK2-AP1 mRNA及蛋白在三種乳腺癌細胞系的表達情況

圖2　通過慢病毒載體轉染使CDK2-AP1在MCF-7細胞靜默、在SK-BR-3細胞過表達。 A CDK2-AP1 siRNA慢病毒轉染MCF-7及CDK2-AP1過表達慢病毒轉染SK-BR-3細胞。B MCF-7轉染CDK2-AP1 RNAi后mRNA降低80.1%。C CDK2-AP1mRNA過表達于SK-BR-3，內(nèi)源性CDK2-AP1mRNA上升3.3倍。D MCF-7轉染后CDK2-AP1蛋白水平降低77.7%。E SK-BR-3轉染后CDK2-AP1蛋白水平上調(diào)。

圖3　CDK2-AP1抑制乳腺癌細胞生長，阻滯乳腺癌細胞于G0/G1及G2/M期，并提高乳腺癌細胞對多烯紫杉醇的化療敏感性。A 干擾后MCF-7細胞克隆形成數(shù)是對照組兩倍，過表達后SK-BR-3克隆數(shù)減少。 B 干擾CDK2-AP1后MCF-7細胞增殖加速至對照組1.31倍。C CDK2-AP1過表達抑制SK-BR-3細胞增殖。D 過表達CDK2-AP1阻滯SK-BR-3細胞于G0/G1、G2/M 期，下調(diào)CDK2-AP1促進MCF-7細胞進入S期。

圖4　CDK2-AP1降低/缺失促進MCF-7細胞裸鼠成瘤、增殖，抑制凋亡。

3　討論

已知CDK2在細胞周期調(diào)控中起著關鍵作用，正常細胞的新陳代謝有賴于CDK2上、下游的調(diào)控，包括CDK2-AP1對CDK2的滅活及增殖細胞的凋亡。失去CDK2-AP1的調(diào)節(jié)，CDK2過表達會導致細胞周期下游信號通路激活、細胞持續(xù)增殖，形成細胞惡變的基礎；而在腫瘤細胞則可能導致其生物學行為的改變比如增殖、侵襲力增強。作者通過臨床標本檢測發(fā)現(xiàn)在乳腺癌存在CDK2-AP1表達降低/缺失而CDK2/ CyclinD1表達升高的情況，CDK2-AP1在正常乳腺組織細胞表達遠高于乳腺癌組織。此結果提示CDK2-AP1與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展存在密切的聯(lián)系：CDK2-AP1表達降低以至缺失導致乳腺細胞進入惡性增殖形成腫瘤，缺乏細胞周期調(diào)控的乳腺癌細胞增殖及侵襲能力增強。

通過CDK2-AP1細胞功能實驗，證實抑制CDK2-AP1表達后乳腺癌細胞周期后移、增殖加快；過表達CDK2-AP1的乳腺癌細胞的細胞周期阻滯在G0/G1和G2/M期，增殖受抑制。同時CDK2/CyclinD1的表達與CDK2-AP1具有明顯的負相關性，提示以CDK2-AP1/CDK2/CyclinD1為核心的細胞周期信號通路在乳腺癌細胞具有重要作用，影響乳腺癌細胞的發(fā)生和進展。動物實驗進一步證實這一推測，接種CDK2-AP1干擾的乳腺癌細胞在裸鼠易于成瘤且生長迅速，顯著高于對照組；在裸鼠腫瘤組織通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)CDK2/CyclinD1的表達升高，bcl-2/ bax比值升高。結果表明CDK2-AP1/CDK2/CyclinD1對動物體內(nèi)乳腺癌細胞的生長調(diào)控具有重要作用，CDK2-AP1降低/缺失會導致細胞周期路徑重要調(diào)控因子CDK2/CyclinD1的持續(xù)活化，且可能因失去對bcl-2的抑制而導致bcl2/ bax比值升高、細胞凋亡減少。以上證據(jù)提示在動物體內(nèi)CDK2-AP1表達降低或缺失會促進腫瘤發(fā)生及進展，而且為細胞周期路徑的調(diào)控作用提供了依據(jù)。

本資料提示CDK2-AP1可以抑制乳腺上皮細胞惡性分化及增殖，其表達降低/缺失促進乳腺癌的發(fā)生及進展。CDK2-AP1具有成為乳腺癌治療手段的潛在可能性。

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Objective To observe the role of CDK2-AP1 in breast cancer. Methods Expressions of CDK2-AP1，CDK2 and CyclinD1 were examined in 209 cases of pathological specimens using IHC staining. Lost-of-function and Gain-of-function assays were performed in vivo and in vitro to assess the specifi c role of CDK2-AP1 in breast cancer. Results The positive ratio of CDK2-AP1 expression was reduced successively in normal breast tissue，DCIS，invasive breast cancer and relapsed breast cancer，suggesting that CDK2-AP1 was correlated closely with the tumor's genesis and progress and might work as a tumor suppressor. After down-regulating CDK2-AP1 in breast cancer cells，the cell cycle was accelerated and the cell proliferation was promoted. The cell cycle was arrested in G0/G1 phase and G2/M phase after up-regulating CDK2-AP1 in breast cancer cells，resulting in inhibited cell proliferation. The same results were obtained by animal assays. Conclusions CDK2-AP1 affects tumor genesis and tumor growth by cell cycle regulation，which has the potential to be a therapeutic agent in breast cancer.

CDK2-AP1 Breast cancer Cell cycle

浙江省衛(wèi)生廳青年人才基金（2010QNA005）；浙江省自然科學基金（Y2110519）

浙江省腫瘤醫(yī)院乳腺外科（何向明 俞洋 楊紅?。┥虾＝煌ù髮W附屬上海第六人民醫(yī)院乳腺外科（黃潤宗祥云）浙江大學附屬第一人民醫(yī)院病理科（向華）