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PEG10診斷HCV相關(guān)性肝硬化和肝癌效果評(píng)價(jià)

張海胡亞華朱燕莉常城 李丹余力群

目的評(píng)價(jià)PEG10對(duì)慢性丙型肝炎（HCV）相關(guān)性肝硬化和肝細(xì)胞癌（HCC）的診斷價(jià)值。方法 選擇HCV患者67例，根據(jù)臨床診斷分為單純慢性HCV組23例、肝硬化組25例和HCC組19例，收集患者性別、年齡、Child-Pugh分級(jí)、ALT、AST和血清AFP等信息，同時(shí)采用RT-PCR法檢測(cè)外周血PEG10 mRNA水平。結(jié)果 AFP的ROC曲線下面積（AUC）為0.768，當(dāng)231 ng/mL為AFP診斷HCC的界值時(shí)，敏感度和特異度分別為52.63％和93.75％，PEG10 mRNA的AUC為0.880，最佳診斷界值為2.09，此時(shí)敏感度和特異度分別為84.21％和87.50％，PEG10診斷效能稍高于AFP，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PEG10 mRNA水平與HCC患者性別、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小和轉(zhuǎn)移情況均不相關(guān)（P ＞0.05）。結(jié)論 PEG10 mRNA在HCC患者的水平明顯高于慢性HCV和肝硬化，同時(shí)PEG10 mRNA與腫瘤大小、數(shù)目、臨床分期均不相關(guān)，是一種理想的HCC診斷指標(biāo)。

PEG10；HCV；肝硬化；原發(fā)性肝癌

肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率極高［1］。在我國大多數(shù)HCC系由乙型肝炎病毒（HBV）所致，近年丙型肝炎后肝硬化有上升的趨勢(shì)，與HBV和其他病因引起的HCC相比，丙型肝炎病毒（HCV）相關(guān)性HCC多發(fā)生于老齡患者，自然病程相對(duì)較長，腫瘤進(jìn)展較緩慢，也有研究認(rèn)為HCV相關(guān)性 HCC較其他原因預(yù)后更差［2］，因此提高HCC的早期診斷率一直是學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。印跡基因父系表達(dá)基因10（Patemally expressed gene 10，PEGl0）是新發(fā)現(xiàn)的遺傳印跡基因，在絕大多數(shù)人肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)，同時(shí)患者外周血中PEG10m RNA表達(dá)升高，對(duì)HCC早期診斷有重要價(jià)值［3］，但對(duì)HCV相關(guān)性HCC判斷意義尚未見報(bào)道。本研究納入67例慢性HCV、丙型肝炎后肝硬化和HCC患者，檢測(cè)外周血PEG10 mRNA表達(dá)差異，評(píng)價(jià)PEG10對(duì)HCV相關(guān)性肝硬化和HCC的診斷價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

收集2011年5月至2014年11月間在我院經(jīng)體格檢查、血清學(xué)、組織病理學(xué)和影像學(xué)確診的病例，所有患者根據(jù)診斷分為慢性HCV組（Metavir評(píng)分≤F3）、肝硬化組（Metavir評(píng)分為F4）和HCC組（根據(jù)2011年版原發(fā)性肝癌診療規(guī)范）［4］，收集完整的臨床資料，包括患者性別、年齡、Child-Pugh分級(jí)、ALT、AST、Edmonson臨床分期和血清AFP等；病理學(xué)資料包括腫瘤大小、數(shù)目、肝外轉(zhuǎn)移情況等。

二、試劑與儀器

試劑：Ficoll外周血淋巴細(xì)胞分離液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，天津），總RNA提取試劑盒（Qiagen，德國），Super-ScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（QIAGENLtd，美國），實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex Taq和DEPC水（Ta KaRa，日本），PBS液（Gibco，美國），無水乙醇（國產(chǎn)分析純）。

儀器：DU800紫外分光光度計(jì)（Nano Vue-Health care Bio-SciencesAB，德國），低溫高速離心機(jī)Eppendorf Centrifuge 5810R、5415R（Eppendorf，德國），Gene Amp PCR System 2400、7900 HT Sequence DetectionSystem（ABI，美國）。PCR儀：Roche Molecular Biochemicals Light Cycler-Gmb H D-68298（德國）。自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀：G-BOX，SYNYENE，SYOR4/1246（美國）。

三、檢測(cè)PEGl0 mRNA表達(dá)［5］

分離外周血單個(gè)核細(xì)胞：每位受試者抽取2 m L靜脈血，以EDTA抗凝，常溫下加緩沖液PBS對(duì)倍稀釋，將稀釋血液緩慢加入Ficoll分離液中，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）；2000 r/min離心15 min；吸出細(xì)胞層，加約10倍的PBS液，混勻；l500 r/min離心5 min；棄上清，加PBS重懸細(xì)胞，l500 r/min離心3 min，棄上清，備用。

引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)NCBI Genbank中PEGl0 mRNA全長序列（基因序列號(hào)：NM015068）采用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成，引物序列上游：TTG TCC ACG AAA CTC ACG，下游：TGT CCA CTG GGAATA CTG，退火溫度51.3℃，片段長度403 bp，

總RNA制備及純度和濃度測(cè)定：按試劑盒說明書步驟操作以溶解抽提總RNA。提取的RNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280，二者比值為1.8～2.0證實(shí)RNA純度良好，低于1.8者重新提取RNA。每份RNA經(jīng)過3次獨(dú)立檢測(cè)，如誤差在允許范圍內(nèi)，則取平均濃度作為最終確定的濃度，稀釋至1μg/μL并分裝，-80℃保存。

逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按lnvitrogen公司SuperSciptⅢ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。工作液含RT bufier、Mgcl2、DTT、RNaseOUT、

SuperScript，加RNA模板，oligo（d T）作為引物，反應(yīng)條件為30℃10 min，42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min，逆轉(zhuǎn)錄完成后得c DNA，置-20℃保存。

FQ RT-PCR檢測(cè)：PCR反應(yīng)體系為10×PCR緩沖液12.5μL，采用SYBRR Premix Ex Taq TM熒光定量PCR試劑盒，取c DNA樣品1.5μL，d NTPS 0.5 μL，引物0.2μL，反應(yīng)條件為94℃3 min，隨后94℃30 s，52℃40 s，72℃40 s，35個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外光照顯帶。

記錄結(jié)果：每份標(biāo)本以PEGl0基因和內(nèi)參基因βactin各重復(fù)3孔，每份樣本的目的基因和內(nèi)參基因分別設(shè)立空白對(duì)照。采用樣點(diǎn)擬合法分析結(jié)果，得到樣本中PEGl0的循環(huán)閾值（Ct）值，PEG10 m RNA的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct方法計(jì)算。

四、診斷效率評(píng)價(jià)

采用ROC曲線比較PEGl0 mRNA和AFP對(duì)肝硬化和HCC的診斷效率，并計(jì)算最佳診斷界點(diǎn)時(shí)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽性似然比、陰性似然比、正確診斷指數(shù)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料以百分率描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Med Calc軟件（Mariakerke，Belgium）生成ROC曲線，分別評(píng)價(jià)AFP和PEG10對(duì)肝硬化和HCC的診斷能力。

結(jié)　果

一、一般情況

符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者共67例，其中單純慢性HCV23例，肝硬化25例，HCC19例；HCC組年齡、AFP和PEG10 mRNA均明顯高于其他兩組（P＜0.05），而慢性HCV和肝硬化患者組間無明顯差異（P＞0.05）；性別、Child-Pugh分級(jí)、ALT和AST組間比較無明顯差異（P＞0.05），見表1。

表1　各組人口學(xué)及病史資料組間比較

二、PEG10與AFP預(yù)測(cè)HCC價(jià)值比較

PEG10和AFP預(yù)測(cè)的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.880和0.768（Z=6.806和4.046，P＜0.0001）；敏感度分別為84.21％和52.63％，特異度分別為87.50％和93.75％，組間比較無差異（AUC差值為0.112，Z=1.351，P=0.177），見表2、圖1。

表2　PEGl0 mRNA和AFP單項(xiàng)檢測(cè)診斷效率的相關(guān)參數(shù)

圖1ROC曲線

三、PEG10 m RNA與患者性別、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小和Edmonson分級(jí)關(guān)系分析

PEG10 mRNA水平與HCC患者性別、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小和轉(zhuǎn)移情況均不相關(guān)（P＞0.05），見表3。

表3　PEG10 mRNA與患者性別、腫瘤數(shù)目、腫瘤大小和轉(zhuǎn)移情況關(guān)系

討　論

HCC是臨床常見惡性腫瘤，由于診斷多為晚期，預(yù)后極差。為提高HCC的早期診斷率，國內(nèi)外學(xué)者做了大量的研究，篩選出AFP、GPC3、MDK、SERPINI1、QP-C和PEG10等大量的生物標(biāo)記物［6］，其中AFP是目前臨床上診斷HCC最常用的生物標(biāo)記物，但該指標(biāo)只在60％～70％的HCC患者中出現(xiàn)升高，而在小肝癌中陽性率更加低至33％～65％［7］，同時(shí)在慢性肝炎和肝硬化患者中，血清AFP同樣出現(xiàn)升高［8］，因此尋找敏感性和特異性更高的診斷指標(biāo)，特別是對(duì)于AFP正常或小肝癌患者具有重要的臨床意義。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是指自發(fā)或因診療操作進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，可以在血液中進(jìn)行檢測(cè)，很多研究都在強(qiáng)調(diào)CTCs的存在和數(shù)量對(duì)腫瘤診斷和預(yù)后的判斷價(jià)值［9，10］。血液是CTCs存在的微環(huán)境，且外周血取材無創(chuàng)、方便，為動(dòng)態(tài)直觀地了解病情變化打開了一扇窗戶［11］。雖然肝組織活檢對(duì)HCC診斷的準(zhǔn)確率更高，但肝臟活檢操作難度較大，相比而言外周血的檢測(cè)技術(shù)更容易在臨床推廣。但是實(shí)體瘤分子生物學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，難以找到一種可靠的DNA異常能代表一類腫瘤，因此目前CTCs的檢測(cè)多用于血液系統(tǒng)的惡性腫瘤［10］。既往的研究發(fā)現(xiàn)，PEG10基因具有更高的肝癌組織特異性，在相應(yīng)的癌旁組織、正常肝組織中以及其它非肝臟來源的腫瘤細(xì)胞中均不表達(dá)，國內(nèi)外均有研究探索PEG10 m RNA與HCC患者的CTCs數(shù)量的相關(guān)性，取得肯定的結(jié)果［12］。目前用于分離CTCs的方法有很多種，相比血細(xì)胞計(jì)算和免疫組化法，F(xiàn)icoll密度梯度離心法簡(jiǎn)便、低廉和較高的恢復(fù)率在臨床上應(yīng)用最廣泛，而RTPCR可以間接通過檢測(cè)DNA或mRNA來反映CTCs的存在，具有較高的可信度［13］，因此本研究采用上述兩種方法進(jìn)行檢測(cè)。

本研究中HCC組性別有明顯差異，男性患者HCC發(fā)生率遠(yuǎn)高于女性患者，這與男性更容易暴露于嗜酒、吸煙和病毒感染的危險(xiǎn)因素有關(guān)，同時(shí)雌激素對(duì)肝癌細(xì)胞的發(fā)生有抑制作用［6］。肝硬化組和HCC組患者年齡無明顯差異，但明顯高于HCV組，這與中國人群丙型肝炎年齡分布接近，大部分的丙型肝炎患者年齡段位于30～39歲之間［14］，該現(xiàn)象也符合HCC的病理進(jìn)展，HCV經(jīng)過10～30年的發(fā)展后容易形成HCC［15］。肝硬化患者在Child分級(jí)中均勻分布，而由于加入本篩查研究，HCC在早期即被發(fā)現(xiàn)而未進(jìn)展至晚期。雖然本研究中大多數(shù)患者AFP＜200 ng/m L，但由于HCC腫瘤細(xì)胞能大量分泌AFP，HCC組患者仍明顯高于非HCC組，表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的診斷效能，稍低于PEG10，但由于樣本量較少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［16］，而兩指標(biāo)在慢性HCV和肝硬化組間均無差異，無法對(duì)兩種疾病進(jìn)行鑒別，結(jié)果與同類研究相近［17］。本研究中，PEG10表達(dá)與腫瘤大小、數(shù)目、臨床分期均無明顯的相關(guān)性，類似的結(jié)果國內(nèi)外均有報(bào)道［3］，表明包括小肝癌病例在內(nèi)的大多數(shù)HCC患者中均有PEG10表達(dá)，適用于HCC的早期篩查。

綜上所述，PEG10 mRNA在HCC患者的水平明顯高于慢性HCV和肝硬化，同時(shí)PEG10 mRNA與腫瘤大小、數(shù)目、臨床分期均不相關(guān)，是一種理想的HCC診斷指標(biāo)。

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2015-04-01）

（本文編輯：易玲）

2013-2014年度湖北省衛(wèi)生廳科研指導(dǎo)性項(xiàng)目（JX6C-48）

435000 湖北 黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）消化內(nèi)科（張海，胡亞華，朱燕莉，常城，余力群），科教科（李丹）

朱燕莉，Email：33575296@qq.com