馮艷紅　邱潔　李麗　吳衛(wèi)鋒　常家寶　楊永峰　周振先

HBe Ag陽性慢性乙型肝炎患者的DC-CIK免疫治療

馮艷紅邱潔李麗吳衛(wèi)鋒常家寶楊永峰周振先

目的用人體自身DC-CIK免疫治療HBe Ag陽性的慢性乙型肝炎患者，觀察HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA以及肝功能的變化，以探討自身DC-CIK免疫治療抗病毒作用。方法 從人血中分離單抗細胞，在體外誘導自體DC細胞，乙型肝炎疫苗負載，和CIK細胞共同培養(yǎng)，制備DC-CIK細胞，給予HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者輸用。每周1次，共5次。檢查治療前后肝功能TBil、ALT、AST，病毒學指標DNA、HBs Ag、HBe Ag定量。結(jié)果 HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者用人體自身DC-CIK免疫治療（5次）4周，前后比較發(fā)現(xiàn)肝功能TBil、ALT、AST有明顯好轉(zhuǎn)，病毒學指標HBs Ag、HBeAg、HBV DNA都有下降，但仍未實現(xiàn)陰轉(zhuǎn)。結(jié)論 HBe Ag陽性的慢性乙型肝炎患者用人體自身DC-CIK免疫治療，在4周時間內(nèi)就有明顯的抗病毒效果，以及肝功能好轉(zhuǎn)的作用。

HBe Ag陽性；慢性乙型肝炎；DC-CIK免疫治療

慢性乙型肝炎又分HBe Ag陽性和HBe Ag陰性慢性乙型肝炎，其中HBe Ag陽性慢性乙型肝炎患者病毒復制活躍，病毒量更高，發(fā)病幾率更大，傳染性更強。目前所用抗HBV核苷類藥物雖然抑制病毒作用強而快，但HBe Ag/抗HBe血清學轉(zhuǎn)化率太低。長期使用導致HBV產(chǎn)生耐藥突變株，引起ALT和HBV DNA突變，導致病情惡化［1］。α-干擾素對HBe Ag陽性慢性乙型肝炎患者HBeAg/抗HBe血清學轉(zhuǎn)化較快，但有效率太低，且降DNA作用差。干擾素與核苷類藥物對HBV在肝細胞內(nèi)復制過程形成的cccDNA仍無能為力。本研究使用DC-CIK免疫細胞治療HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者，觀察此療法的抗病毒作用，現(xiàn)報道如下。

資料和方法

一、研究對象

按照2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》［2］診斷標準，選擇近3年我院收治的HBeAg陽性、HBV DNA陽性、ALT異常（40～400 IU/L）慢性乙型肝炎患者18例，年齡平均36歲（19～48歲），男10例，女8例。比較18例患者在DC-CIK細胞治療前后肝功能、HBe Ag、HBs Ag、DNA的變化，從而探討DC-CIK細胞的抗病毒作用。

二、方法

DC-CIK細胞療法：無菌條件下取患者外周靜脈血10 m L，用0.9％氯化鈉溶液以1∶1的比例稀釋后沿離心管壁緩慢加到淋巴細胞分離液上，2 000 r/min離心20 min后，取白膜層細胞，0.9％氯化鈉溶液洗滌2次，以無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，調(diào)整細胞數(shù)為2 ×106/m L轉(zhuǎn)到培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育3 h，分離黏附細胞及非黏附細胞。黏附細胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入細胞因子1 000 k U/L集落刺激因子（CSF）、500 k U/L白介素-4，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天半量換液并添加細胞因子，第6 d加入表面抗原20 mg/L及腫瘤壞死因子500μg/L，培養(yǎng)第7 d收集細胞。而非黏附細胞用無血清培養(yǎng)基懸浮，加入細胞因子10 k U/L干擾素、500 k U/L白介素-2、500μg/LCD3單克隆抗體及100 k U/L白介素-1，隔天換液，在培養(yǎng)第7 d加入培養(yǎng)的樹突狀細胞（DC），繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，收集細胞給予患者以靜脈回輸。回輸5次，時間為1個月。治療前后檢查患者肝功能TBil、ALT、AST、HBe Ag、HBs Ag、HBV DNA，以研究DC-CIK免疫細胞治療對HBe Ag陽性患者的抗病毒作用。

三、統(tǒng)計學處理

利用SPSS15.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。試驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，P≤0.05者，表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　果

一、DC-CIK免疫細胞治療對肝功能的影響

治療前后TBil都在正常范圍，治療后較治療前數(shù)值有所下降。ALT治療前均值112.28 IU/L，治療后均值46.62 IU/L，下降明顯，P 值為0.01，差異有顯著性統(tǒng)計學意義。AST治療后也有下降。但治療前后TBil和AST差異均沒有統(tǒng)計學意義。結(jié)果說明DC-CIK治療能使患者肝功能好轉(zhuǎn)。

表1　DC-CIK治療前后肝功能的比較

二、DC-CIK治療前后HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA的影響

表2中說明，HBs Ag、HBeAg、HBV DNA在DCCIK治療后均有下降，但治療前后比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

其中5例患者（27.78％），年齡19～26歲，治療前ALT 300～400 IU/L，治療后HBs Ag、HBe Ag、DNA下降比較明顯，治療后12周實現(xiàn)HBe Ag/HBe Ab轉(zhuǎn)換，HBV DNA降至正常。

表2　DC-CIK治療前后HBs Ag、HBeAg、HBV DNA的比較

三、DC-CIK治療的不良反應(yīng)

除個別患者有輕微發(fā)熱不適，無其他不良反應(yīng)。

討　論

慢性乙型肝炎患者DC功能低下或缺陷，導致機體T、B淋巴細胞應(yīng)答呈耐受狀態(tài)。CHB患者體內(nèi)DC的功能缺陷具體表現(xiàn)為［3-5］CHB感染者循環(huán)中DC表達的HLA-DR和共刺激分子B7（CD80/CD86）減少，混合淋巴細胞反應(yīng)能力下降，外周血單核細胞（PBMC）中產(chǎn)IFN-γ的DC前體細胞（pre-DC，p DC）的數(shù)量和功能也顯著下降。研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎DC的表型與提呈能力與HBV的載量有密切關(guān)系［6］。DC經(jīng)抗原刺激后向淋巴結(jié)遷移，將其攜帶的抗原信息傳遞給相應(yīng)的T淋巴細胞，激發(fā)、增強并重建CHB患者抗HBV特異性T細胞與B細胞免疫應(yīng)答，特異性地清除病毒與病毒感染的細胞，從根本上清除HBV感染，解除CHB患者HBV長期持續(xù)感染狀態(tài)，產(chǎn)生長久療效。

經(jīng)抗原刺激后的DCs還分泌多種細胞因子，增強抗體非特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮“天然免疫佐劑”的作用。將CHB患者的淋巴細胞體外進行激活，形成細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK）和樹突狀細胞激活的細胞因子誘導的殺傷細胞（DC-CIK）可直接改善免疫狀態(tài)。同時CIK、DC-CIK分泌大量天然免疫因子（IFNs，IL-2，IL-12等），促進特異性免疫，有助于快速打破CHB患者的免疫耐受。

DC-CIK治療慢性乙型肝炎技術(shù)，是在體外將患者單核細胞用IFN-α，IL-2等細胞因子誘導和擴增為CIK后，再與用GM-CSF、IL-4等細胞因子誘導的具有極強抗原呈遞功能的DC共培養(yǎng)，并加入HBV特異性抗原，之后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)達到特異性殺傷乙型肝炎病毒的方法。

本研究結(jié)果顯示，18例HBe Ag陽性慢性乙型肝炎患者經(jīng)DC-CIK治療后4周，HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA都有一定程度的下降，但治療前后比較差異無統(tǒng)計學意義，說明DC-CIK治療能使HBe Ag陽性乙型肝炎患者的HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA下降，具有一定的抗病毒作用。但治療后第4周還未能實現(xiàn)HBs Ag/HBe Ab轉(zhuǎn)換及HBV DNA 陰轉(zhuǎn)，更未能實現(xiàn)HBs Ag的陰轉(zhuǎn)。其中5例（27.78％）年齡較輕者，治療前ALT較高者，效果更顯著，12周實現(xiàn)HBs Ag/HBe Ab轉(zhuǎn)換及HBV DNA陰轉(zhuǎn)。

重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院任紅教授研究小組對19例CHB患者用HBsAg負載的DC疫苗進行治療（皮下注射兩次，間隔2周），11/19（57.9％）有臨床應(yīng)答，10/19（52.6％）HBe Ag轉(zhuǎn)陰，HBV DNA平均下降101.77±2.39。其中兩例聯(lián)用拉米夫定治療的患者產(chǎn)生了完全臨床應(yīng)答［7］。解放軍三○二醫(yī)院王福生教授研究小組對21例CHB患者進行CIK治療（輸注3次，間隔1 d），CIK治療后，血清ALT水平和HBV DNA水平呈下降趨勢，其中1例患者對拉米夫定耐藥，進行CIK治療后，血清ALT和HBV DNA下降，持續(xù)20周，并出現(xiàn)了HBe Ag/抗-HBe的血清學轉(zhuǎn)換［8］。楊莉［9］、康海燕［10］均是用DC-CIK聯(lián)合干擾素治療慢性乙型肝炎，研究結(jié)果3個月時即有ALT、HBs Ag、HBV DNA好轉(zhuǎn)，6個月時效果更好；比單用干擾素效果好。韓際奧等［11］報道單用DC-CIK治療慢性乙型肝炎，24周后ALT、HBs Ag、HBV DNA都有下降，認為DC-CIK聯(lián)合回輸有抗乙型肝炎病毒作用，可以使肝功能好轉(zhuǎn)。

本研究DC-CIK聯(lián)合培養(yǎng)回輸，治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎（未聯(lián)合干擾素），治療后4周，在抗病毒及ALT恢復方面都顯示有效。ALT較高者、年輕者，效果較為顯著。因為回輸次數(shù)有限，觀察時間有限，還未達到理想效果。DC-CIK單用免除了注射干擾素的諸多副作用，避開了服用核苷類藥物的耐藥以及時間過長等不利因素，不失為一種患者愿意接受的方法。

1斯崇文.對當前慢性乙型肝炎抗病毒治療的看法.中華傳染病雜志，2005，23：73-74.

2中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.肝臟，2011，16：2-16.

3Duan XZ，Zhuang H，Wang M，et al.Decreased numbers and impaired function of circulating dendritic cell subsets in patients with chronic hepatitis B infection（R2）.J Gastroenterol Hepatol，2005，20：234-242.

4Zheng BJ，Zhou J，Qu D，et al.Selective functional deficit in dendritic cell-T interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection.J Viral Hepat，2004，11：217-224.

5Tavakoli S，Schwerin W，Rohwer A，et al.Phenotype and function of monocyte derived dendritic cells in chronic hepatitis B virus infection.J Gen Virol，2004，85：2829-2836.

6錢峰，賀永文，朱傳武，等.慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細胞表型及抗原提呈能力與HBV載量的關(guān)系.肝臟，2005，10：8-10.

7Chen M，Li YG，Zhang DZ，et al.Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B：a clinical study.World J Gastroenterol，2005，11：1806-1808.

8Shi M，Qian S，Chen WW，et al.Hepatitis B virus（HBV）antigen-pulsed monocyte-derived dendritic cells from HBV-associated hepatocellular carcinoma patients significantly enhance specific T cell responses in vitro.Clin Exp Immunol，2007，147：277-286.

9楊莉，趙召霞，許怡，等.DC-CIK細胞療法聯(lián)合干擾素治療慢性乙型肝炎臨床研究.河北醫(yī)藥，2010，32：2647-2648.

10康海燕，王建彬，董江龍，等.自體DC、CIK回輸聯(lián)合干擾素治療慢性乙型肝炎的臨床觀察.山東醫(yī)藥，2011，51：55-56.

11韓際奧，馬應(yīng)杰，王志凌，等.DC-CIK治療慢性乙型肝炎患者療效觀察.肝臟，2013，18：677-679.

2015-03-01）

（本文編輯：易玲）

南京市衛(wèi)生局醫(yī)學科技發(fā)展項目（YKK11079）

210003 江蘇 東南大學附屬南京市第二醫(yī)院肝病科（馮艷紅，邱潔，李麗，吳衛(wèi)鋒，常家寶，楊永峰），生物細胞室（周振先）

馮艷紅，Email：aaa＿mike@sina.com