張懿　倪鎏達(dá)　周豐　楊峻　程明亮　傅青春　陳成偉　吳銀霞

還原型谷胱甘肽對多柔比星處理Hep G2細(xì)胞株效果的影響

張懿倪鎏達(dá)周豐楊峻程明亮傅青春陳成偉吳銀霞

目的研究還原型谷胱甘肽（GSH）對多柔比星（DOX）處理HepG2細(xì)胞株增殖及凋亡的影響；探索核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB p65、Bcl-2在DOX單藥及聯(lián)合GSH誘導(dǎo)Hep G2細(xì)胞凋亡后的表達(dá)及其意義。方法 實(shí)驗(yàn)分4組，空白組：培養(yǎng)液，對照組：培養(yǎng)液+Hep G2細(xì)胞+RPMl l640培養(yǎng)基，DOX組：培養(yǎng)液+Hep G2細(xì)胞+DOX，DOX+GSH組：培養(yǎng)液+HepG2細(xì)胞+DOX+GSH。MTT法檢測HepG2細(xì)胞生長，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期凋亡率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測NF-κB p65 m RNA的表達(dá)，Western印跡檢測NF-κB p65及Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 （1）DOX組和DOX+GSH組作用細(xì)胞24 h、48 h、72 h均能顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，DOX組抑制率顯著高于DOX+GSH組（P＜0.05），且抑制率具有時(shí)間和劑量依賴性。（2）對照組凋亡率為（0.733±0.153）％，DOX組凋亡率為（28.400±0.007）％，DOX+GSH組凋亡率為（15.500±0.006）％；DOX組、DOX+GSH組分別與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；DOX組與DOX+GSH組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（3）兩組在處理細(xì)胞24 h后，DOX+GSH組NF-κB p65mRNA表達(dá)顯著高于DOX組（P＜0.05）。（4）DOX組NF-κB p65、Bcl-2表達(dá)較對照組增高，DOX+GSH組表達(dá)較DOX組表達(dá)增高。結(jié)論 GSH與DOX聯(lián)合使用可導(dǎo)致DOX化療效果下降，其機(jī)制可能是通過進(jìn)一步上調(diào)NF-κB p65和Bcl-2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。臨床上使用DOX化療的腫瘤患者應(yīng)避免同時(shí)使用GSH。

還原型谷胱甘肽；多柔比星；人肝癌細(xì)胞株；HepG2

一篇描述采用N-乙酰半胱氨酸（NAC）預(yù)防經(jīng)常發(fā)生的肝細(xì)胞毒性而使福莫司汀化療效果喪失的個(gè)案報(bào)告［1］，提醒我們想要獲得好的化療效果，不但要避免或減輕肝損傷，而且選擇合適保肝治療方式也尤為重要。本課題通過觀察還原型谷胱甘肽（GSH）對多柔比星（DOX）處理Hep G2細(xì)胞株增殖及凋亡的變化，評價(jià)GSH對DOX抗腫瘤治療的效果影響。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分4組，即空白組：培養(yǎng)液，對照組：培養(yǎng)液+HepG2細(xì)胞+RPMl l640培養(yǎng)基，DOX組：培養(yǎng)液+Hep G2細(xì)胞+DOX，DOX+GSH組：培養(yǎng)液+Hep G2細(xì)胞+DOX+GSH。實(shí)驗(yàn)藥物濃度設(shè)置據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道前期篩選［2-4］，DOX濃度：0.125μg/mL、0.25μg/m L、0.5μg/m L、1μg/m L、2μg/m L；GSH濃度設(shè)置：100μg/m L。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株Hep G2由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院感染科惠贈(zèng)。用含雙抗（100 U/m L青霉素、100 mg/m L鏈霉素）、10％胎牛血清的RPMll640培養(yǎng)基，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、相對濕度95％的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長，每2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

三、主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶消化液購于美國Gibco公司；雙抗（青鏈霉素混合液）購于美國Hyclone公司；注射用鹽酸多柔比星購于江蘇海正藥業(yè)；注射用還原型谷胱甘肽購于重慶藥友；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT粉）購于美國Sigma公司；SDSPAGE凝膠配制試劑盒、Annexin V—FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）、Actin抗體、Histone H3抗體購于碧云天公司；兔抗人Bcl-2抗體（N-19）、兔抗人NF-κB p65抗體（C-20）購于美國Santa cruz公司。

四、MTT法測定生長抑制率

取對數(shù)生長期Hep G2細(xì)胞，按濃度為5×103個(gè)/m L接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，吸盡上清液，各組分別加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液。置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔。分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入10μL MTT溶液，輕振培養(yǎng)板，放回培養(yǎng)箱內(nèi)再孵育4 h后，吸盡上清液，每孔加入100μL DMSO終止反應(yīng)，震蕩15 min混勻后用酶標(biāo)儀（波長490 nm）測定吸光度（A）值。細(xì)胞生長抑制率公式：（對照組A值-空白組A值）-（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

五、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率

對照組、DOX組（2μg/m L）、DOX（2μg/m L）+ GSH組（100μg/m L）處理細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入適量0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶 的過 度消化。采用Annexin-VFITC、PI雙染色試劑盒，按試劑盒說明進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

六、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組NF-κB p65mRNA的表達(dá)

應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件和Web Primer 3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。NF-κB p65上游引物序列5′-GACTACGACCTGAATGCTGTG-3′，下游引物5′-TGTCAAAGATGGGATGAGAAAG-3′。GAPDH上游引物序列5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′，下游引物5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3′。以A（NF-κBp65）/A（GAPDH）比值表示目的基因的相對表達(dá)量。

各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，提取各組細(xì)胞RNA。核酸蛋白定量儀測定RNA 的含量和純度，取A 260/A 280＞1.8的樣品用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)，并將RNA濃度稀釋到100 ng/μL，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。配制反應(yīng)體系：反應(yīng)混合液10μL，各1μL上下游引物，5μL稀釋后cDNA，3μL DEPC-treated water，總體積20μL。每個(gè)樣本2對引物，每對引物3復(fù)孔。反應(yīng)條件：50℃2 min，95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min 40個(gè)循環(huán)。程序完成調(diào)整閾值計(jì)算結(jié)果。

七、Western印跡檢測NF-κB p65及Bcl-2的表達(dá)

收集細(xì)胞，按照核漿蛋白分離試劑盒分離細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白。BCA法測定蛋白濃度。分別取核蛋白和漿蛋白樣品進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，在4℃條件下維持恒流350 m A，75 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。室溫封閉1 h，棄去封閉液，TBST緩沖液清洗3遍，每次5 min。漿蛋白膜分別與兔抗人NF-κB p65抗體、兔抗人Bcl-2抗體，Actin作為內(nèi)參照；核蛋白膜分別與兔抗人NF-κB p65抗體、兔抗人Bcl-2抗體，H3作為內(nèi)參照，4℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG室溫?fù)u床上孵育1 h。ECL試劑顯色反應(yīng)，拍攝照片，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS19.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，各組間均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

一、細(xì)胞生長抑制率

MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率見圖1-3，不同濃度DOX能抑制Hep G2細(xì)胞生長，抑制率存在時(shí)間劑量依賴性效應(yīng)。聯(lián)合GSH 100μg/m L處理后Hep G2細(xì)胞生長抑制率也同樣存在時(shí)間劑量依賴性細(xì)胞毒效應(yīng)，但抑制率低于DOX組。

圖1　24 h DOX組與DOX+GSH組抑制率比較

圖2　48 h DOX組與DOX+GSH組抑制率比較

二、流式細(xì)胞儀測定早期細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞儀檢測DOX 2μg/mL及DOX 2μg/m L聯(lián)合GSH 100μg/m L處理HepG2細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡率見圖4-6。對照組細(xì)胞凋亡率為（0.633± 0.153）％，DOX組細(xì)胞凋亡率為（28.400± 0.007）％，DOX+GSH組細(xì)胞細(xì)胞凋亡率為（15.500 ±0.006）％，DOX組、DOX+GSH組分別與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），DOX組與DOX+ GSH組相比亦差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3　72 h DOX組與DOX+GSH組抑制率比較

圖4　對照組凋亡率

三、NF-κB p65mRNA表達(dá)

不同濃度DOX組及聯(lián)合GSH 100μg/m L處理HepG2細(xì)胞24 h后采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測各組NF-κB p65mRNA（圖7），24 h NF-κB p65mRNA相對表達(dá)量DOX組低于DOX+GSH組（P＜0.05）。

圖5　DOX組凋亡率

圖6　DOX+GSH組凋亡率

圖7　不同濃度DOX 24 h NF-κB p65m RNA相對表達(dá)量

四、Western印跡檢測NF-κB p65及Bcl-2的表達(dá)

DOX 2μg/m L、及DOX 2μg/m L聯(lián)合GSH 100 μg/m L處理Hep G2細(xì)胞24 h后，采用Western印跡檢測細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65及漿蛋白中Bcl-2的表達(dá)（圖8），DOX+GSH組表達(dá)較DOX組表達(dá)增高，均高于對照組。

圖8NF-κB p65、Bcl-2相對表達(dá)量

討　論

在接受聯(lián)合化療方案的患者中通常出現(xiàn)輕到中度的肝功能異常，接受環(huán)磷酰胺、阿霉素和5-FU治療無肝轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，大約85％出現(xiàn)肝功能異常［5］。因此，為了減輕或消除化療藥物對肝臟的不良反應(yīng)，臨床上對接受化療的患者常常使用保肝藥物，其中抗氧化劑被廣泛應(yīng)用［6，7］。DOX是常用的化療藥物，也是肝癌單一化療少數(shù)幾個(gè)有效的藥物之一。GSH是目前臨床上最常用的保肝藥物，與化療藥物合用已被默認(rèn)為常規(guī)，但其是否影響化療藥物抗腫瘤的效果尚有爭論。

本研究通過觀察GSH對DOX處理Hep G2細(xì)胞株的影響，發(fā)現(xiàn)GSH 可降低DOX抑制Hep G2細(xì)胞的增殖。采用MTT法測定細(xì)胞生長抑制率，通過篩選得出DOX和GSH對Hep G2細(xì)胞的有效作用時(shí)間和作用濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：DOX濃度為0.125μg/mL、0.25μg/m L、0.5μg/m L、1μg/m L、2μg/m L時(shí)，作用24 h、48 h、72 h均能抑制HepG2細(xì)胞的增殖；上述不同濃度DOX分別和GSH聯(lián)合，作用24 h、48 h、72 h也能抑制Hep G2細(xì)胞的增殖，而DOX組抑制率高于DOX+GSH組，結(jié)果提示GSH降低DOX抑制HepG2細(xì)胞的增殖；再采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，對照組細(xì)胞凋亡率最低，DOX組顯著高于DOX+ GSH組，從而佐證了GSH降低DOX抑制Hep G2細(xì)胞增殖的結(jié)論。

GSH降低DOX抑制HepG2細(xì)胞增殖的機(jī)制何在？腫瘤細(xì)胞死亡方式包含壞死和凋亡，NF-κB常被認(rèn)為是抗凋亡因子，其可以誘導(dǎo)凋亡蛋白抑制因子、細(xì)胞類FLICE抑制蛋白（c-FLIP）及Bcl-x L家族等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤無限增殖［8，9］。NF-κB在癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的作用是使后者具有拮抗凋亡和逃避免疫監(jiān)控的能力，并且在腫瘤發(fā)生和腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生過程中起到了重要的作用［10］。外源性補(bǔ)充GSH是否能激活NF-κB通路影響DOX的抗腫瘤效果。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測NF-κB p65m RNA的表達(dá)，結(jié)果DOX+GSH組NF-κB p65m RNA的相對表達(dá)量明顯高于DOX組。再通過Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)，結(jié)果DOX+GSH組NF-κB p65表達(dá)高于DOX組。與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，說明DOX除了能夠引起NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核以控制轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還能直接引起NF-κB的表達(dá)升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11，12］。使用NF-κB抑制劑可以提高化療藥物的化療效果［10，13］，本研究中GSH似乎通過激活NF-κB通路減少Hep G2細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族是目前研究的最深入和廣泛的凋亡調(diào)控基因家族。細(xì)胞是否凋亡是由促凋亡因子和抗凋亡因子的相互作用來決定［14］，Bcl-2家族的促凋亡因子包括Bax、Bak和Box等，抗凋亡因子包括Bcl-2、Bcl-x L和Bcl-w等。Bcl-2家族DNA的激動(dòng)子上有NF-κB結(jié)合序列［15］，這種NF-κB依賴的Bcl-2激活可以保護(hù)細(xì)胞在化療藥作用下不死亡［16］。Bcl-2蛋白家族影響細(xì)胞凋亡，這種古老的細(xì)胞自殺性程序，其對于細(xì)胞的發(fā)展、組織穩(wěn)態(tài)和免疫是最基本的。凋亡太少，可以促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生和自身免疫性疾病；凋亡太多，將會促進(jìn)缺血和神經(jīng)性退變［17］。Bcl-2家族中研究最多的Bcl-2蛋白在許多種類的癌細(xì)胞中都存在過表達(dá)的現(xiàn)象，它能促進(jìn)細(xì)胞存活而不是促進(jìn)細(xì)胞增殖［18］，能夠影響腫瘤凋亡，在腫瘤發(fā)展中是一個(gè)關(guān)鍵的步驟［19］。Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Bcl-2的表達(dá)水平同細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)水平一致，DOX+GSH組表達(dá)較DOX組表達(dá)增高，從而推測GSH可通過上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)、激活NF-κB通路抑制HepG2細(xì)胞凋亡。

Del Olmo等［20］通過B16F10黑色素瘤肝轉(zhuǎn)移小鼠模型研究表明，內(nèi)源性GSH可以保護(hù)DNA免受環(huán)磷酰胺的損傷，也支持GSH聯(lián)合DOX處理人肝癌細(xì)胞株Hep G2使DOX的化療效果降低之結(jié)果，其機(jī)制可能是通過GSH激活NF-κB信號通路，并進(jìn)一步上調(diào)NF-κB p65、Bcl-2的表達(dá)，啟動(dòng)了抗凋亡途徑，從而影響DOX的療效。

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Effects of reduced glutathione against doxorubicin in HepG2 cell line

ZHANG Yi，NI Liu-da，ZHOU Feng，YANG Jun，CHENG Ming-liang，F(xiàn)U Qing-chun，CHEN Cheng-wei，WU Yin-xia.Department of Infection Diseases，Guiyang medical college，Guiyang 550004，China

Objective To study the effects of reduced glutathione（GSH）on doxorubicin（DOX）induced proliferation and apoptosis in Hep G2，and to investigate the expression of NF-κB p65，Bcl-2 in apoptostic Hep G2 induced by DOX monotherapy and DOX combination with GSH，respectively.Methods Four groups were devided，including blank group：RPMl l640 medium only；control group：Hep G2 cells were cultured in the same volume of medium；DOX group：cells were cultured in medium containing DOX；DOX+GSH group：cells were cultured in medium containing DOX and GSH.MTT assay was performed to probe proliferation of Hep G2 cell.Flow cytometry was carried out to determine early apoptosis rate of Hep G2 cells.Real-time polymerase chain reaction was administered to investigate NF-κB p65m RNA expression.Western blotting was used to document protein expression of NF-κB p65 and Bcl-2.The experimental data was analyzed by SPSS version 19.0 software.Results （1）Hep G2 cell proliferation was inhibited time-and dose-dependently in both DOX group and DOX+GSH group at 24 h or 48 h or 72 h.Additionally，the proliferation rate was higher in DOX group than that in DOX+GSH group（P＜0.05）.（2）The apoptosis rate of Hep G2 was（0.733±0.153）％in control group，（28.400 ±0.007）％in DOX group，（15.500±0.006）％in DOX+GSH group，respectively，which showed statistically significant difference between the later two groups and control group（P＜0.01），as well as between DOX group and DOX+GSH group（P＜0.01）.（3）The m RNA expression of NF-κB p65 in DOX+GSH group was higher than that in DOX group（P＜0.05）.（4）The protein expression of NF-κB p65 and Bcl-2 in DOX+GSH group was higher than that in DOX group（P＜0.05）.Conclusion DOX and GSH combination therapy could attenuate chemotherapeutic effect though a potential mechanism by increasing expression of NF-κB p65 and Bcl-2.The combination of DOX and GSH in chemotherapy for cancer patients should be avoided.

Reduced glutathione；Doxorubicin；Human hepatoma cell line；Hep G2

2015-07-06）

（本文編輯：錢燕）

中國肝炎防治基金會天晴肝病研究基金（TQGB20120016）

550001 貴陽貴州醫(yī)科大學(xué)［張懿（現(xiàn)在西安市兒童醫(yī)院），程明亮，吳銀霞］；解放軍第八五醫(yī)院南京軍區(qū)肝病中心（倪鎏達(dá)，周豐，楊峻，傅青春）

倪鎏達(dá)，Email：nld85d@163.com