高郡煥，李學鵬，*，劉　裕，儀淑敏，勵建榮，*，李鈺金，林　洪

（1.渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧 錦州 121013；2.泰祥集團 山東海洋食品營養(yǎng)研究院，山東 榮成 264303；3.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

響應面試驗優(yōu)化四角蛤蜊調味料風味前體物質酶解制備工藝

高郡煥1，李學鵬1，*，劉裕1，儀淑敏1，勵建榮1，*，李鈺金2，林洪3

（1.渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧 錦州 121013；2.泰祥集團 山東海洋食品營養(yǎng)研究院，山東 榮成 264303；3.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

以四角蛤蜊肉為原料，利用酶解技術獲得四角蛤蜊調味料風味前體物質。以水解度和感官評價為指標，確定酶的種類與比例。在單因素試驗的基礎上，使用中性蛋白酶和復合風味蛋白酶，通過Box-Behnken響應面分析法，研究雙酶酶解四角蛤蜊的工藝條件。研究結果：當中性蛋白酶和復合風味蛋白酶質量比為2∶1時，其酶解液的水解度和鮮度都最佳；雙酶酶解最佳條件為酶添加量2.4‰、時間5.5 h、溫度52 ℃、料液比1∶4（g/g）、自然pH值，此時酶解液的水解度較大（44.32%），風味較好。

四角蛤蜊；酶解；水解度；海鮮調味料

據中國調味品協(xié)會的統(tǒng)計，調味品行業(yè)整體年增長20%以上，是食品行業(yè)中增幅最快的行業(yè)之一，其中尤以復合調味品的發(fā)展速度為最快，達到30%～40%［1］。隨著生活水平的提高，營養(yǎng)型、天然風味型、功能型的調味品越來越受到消費者的青睞。海鮮調味料因含有氨基酸、多肽等呈味物質和功能性生物活性物質，逐漸成為調味品工業(yè)的一個重要門類，研究熱度也日趨提高［2］。姚芳等［3］酶解淡水魚下腳料釀制了風味調味汁，李琳等［4］將低值魚進行酶解制得海鮮復合調味料，韓曉祥等［5］酶解中國對蝦下腳料制得調味料風味前體物質，陳超等［6］利用貝類加工廢棄物研制復合海鮮調味料，趙陽等［7］利用雙酶同步酶解工藝和自溶工藝制備紫貽貝海鮮風味肽。

四角蛤蜊（Mactra veneriformis）屬于軟體動物門（Mollusca），瓣鰓綱（Lamellibranchia），蛤蜊科（Mactridae）［8］，在我國沿海一帶分布極廣，尤以遼寧、山東產量最多［9］。它含有豐富的蛋白質和多糖等營養(yǎng)成分，中醫(yī)認為四角蛤蜊肉有滋陰、利水、化痰的功效［10］。目前，國內外已有許多學者從四角蛤蜊不同季節(jié)營養(yǎng)變化［11］、多糖［12］和抗氧化性肽［13］等生物活性物質的提取和特性等方面進行研究。但四角蛤蜊等低值貝類的加工利用率仍然很低，多數加工仍以初級加工為主，產品形式單一，造成了嚴重的資源浪費［14］。騰瑜等［15］研究了四角蛤蜊的營養(yǎng)性，指出四角蛤蜊中鮮味氨基酸的含量高達55.4%，可開發(fā)為調味料，但利用生物酶解技術制備四角蛤蜊海鮮調味料的研究仍鮮見報道。本研究以四角蛤蜊為原料，采用單因素試驗和響應面設計研究其酶解工藝，制備四角蛤蜊調味料風味前體物質，為天然海鮮調味料的開發(fā)提供理論依據和方法指導，同時為四角蛤蜊的深加工提供參考途徑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

鮮活四角蛤蜊于3月上旬購買于錦州市林西街水產市場，平均質量約20 g/個。

中性蛋白酶（0.8 AU/g）、復合蛋白酶（1.5 AU/g）、復合風味蛋白酶（500 LAPU/g）、堿性內切蛋白酶（2.4 AU/g） 諾維信（中國）生物技術有限公司；木瓜蛋白酶（1×105U/g） 上海如吉生物科技有限公司；鹽酸、硫酸（分析純） 錦州古城化學試劑廠；氫氧化鈉（分析純） 天津市風船化學試劑科技有限公司；甲醛（分析純） 天津市天力化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

JY-10型小型粉碎機 濟南九陽有限公司；FA1004型精密電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；FE20-FiveEasy? pH計、PL602-L型分析天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Biofuge?Stratos臺式高速冷凍離心機賽默飛世爾科技公司。

1.3方法

1.3.1工藝流程

四角蛤蜊肉→前處理（加水、絞碎）→調節(jié)pH值→保溫酶解→滅酶（沸水浴10 min）→冷卻→離心（4 000 r/min，10 min，4 ℃）→四角蛤蜊肉酶解液

1.3.2水解度測定

水解度是指底物蛋白質中被水解肽鍵數占肽鍵總數的百分數［16］，計算如式（1）所示：

總氮含量采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法測定；游離氨基酸態(tài)氮含量參考侯曼玲［17］的方法進行測定，具體步驟如下：

取10 mL定容好的四角蛤蜊肉酶解液于200 mL的燒杯中，并加入60 mL蒸餾水。在磁力攪拌狀態(tài)下，用0.05 mol/L的NaOH標準溶液滴定至pH 8.2，加入10 mL的甲醛混勻后，繼續(xù)用上述NaOH標準溶液滴定至pH 9.2，記錄消耗NaOH標準液的量，按式（2）計算氨基酸態(tài)氮含量。

式中：X為樣品中氨基酸態(tài)氮的質量分數/%；V1為樣品加入甲醛滴定至終點（pH 9.2）所消耗NaOH標準溶液的體積/mL；V0為空白加入甲醛滴定至終點所消耗的NaOH標準溶液的體積/mL；V為試樣稀釋液取用量/mL；c為NaOH標準溶液的濃度/（mol/L）；0.014為N的毫摩爾質量/（g/mmol）；10為四角蛤蜊肉底物質量/g。

1.3.3四角蛤蜊肉水解工藝優(yōu)化

1.3.3.1酶種類對四角蛤蜊肉水解度的影響

選取堿性蛋白酶、復合風味蛋白酶、復合蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶這5 種酶進行水解，水解條件為料液比1∶2，即10 g肉加20 g的蒸餾水勻漿，酶添加量3‰（占底物質量分數），堿性蛋白酶58 ℃、pH 7.2，復合風味蛋白酶50 ℃、pH 6.0，復合蛋白酶40 ℃、pH 6.2，木瓜蛋白酶55 ℃、pH 6.5，中性蛋白酶45 ℃、pH 6.2，酶解1、3、5、8、12 h，比較5 種酶的水解度大小與酶解液的風味。每個水平分別重復3 次，結果表示為±s的形式。

1.3.3.2復合酶質量比對四角蛤蜊肉水解度的影響

酶解條件為料液比1∶2、溫度45 ℃、時間3 h、自然pH值（即將四角蛤蜊肉與水按一定比例勻漿后不用酸堿調節(jié)pH值）、酶添加量3‰，改變中性蛋白酶和復合風味蛋白酶的質量比（2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2），以水解度和鮮味為指標，確定最佳復配條件。

1.3.3.3酶解時間對四角蛤蜊肉水解度的影響

取7 份四角蛤蜊肉（每份10 g），加20 g蒸餾水勻漿，分別加入2‰中性蛋白酶和1‰復合風味蛋白酶，自然pH值，45 ℃分別酶解2、3、4、5、6、7、8 h，沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液定容到100 mL，測定其水解度。

1.3.3.4酶解溫度對四角蛤蜊肉水解度的影響

取5 份四角蛤蜊肉（每份10 g），加20 g蒸餾水勻漿，分別加入2‰中性蛋白酶和1‰復合風味蛋白酶，不調pH值，分別在30、40、50、60、70 ℃酶解6 h，沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液定容到100 mL，測定其水解度。

1.3.3.5初始pH值對四角蛤蜊肉水解度的影響

取5 份四角蛤蜊肉（每份10 g），加20 g蒸餾水勻漿，分別加入2‰中性蛋白酶和1‰復合風味蛋白酶，調pH值分別為4、5、6、7、8，50 ℃酶解6 h，沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液定容到100 mL，測定其水解度。

1.3.3.6酶添加量對四角蛤蜊肉水解度的影響

取6 份四角蛤蜊肉（每份10 g），加20 g蒸餾水勻漿，分別加入0.3‰、0.9‰、1.5‰、2.1‰、2.7‰、3‰的混合蛋白酶（中性蛋白酶與復合風味蛋白酶質量比2∶1），調pH 7，50 ℃酶解6 h，沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液定容到100 mL，測定其水解度。

1.3.3.7料液比對四角蛤蜊肉水解度的影響

取5 份四角蛤蜊肉（每份10 g），按料液比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6加入蒸餾水后勻漿，加入1.4‰中性蛋白酶和0.7‰復合風味蛋白酶，調pH 7，50 ℃酶解6 h，沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液定容到100 mL，測定其水解度。

1.3.3.8響應面試驗優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，選擇溫度、時間、酶添加量和初始pH值這4 個因素，以水解度為響應值，根據Design-Expert V8.0.6軟件中Box-Behnken法設計響應面試驗方案，其相應的因素水平見表1。

表1　響應面試驗設計因素與水平Tabel　Factors and coded levels for response surface design

1.3.4感官分析

感官評定小組由8 名食品專業(yè)的感官評價人員組成（年齡在20～40 歲之間）。待評定樣品NaCl含量為0.5%，溫度為（25±1）℃。

5 種酶解液的風味差距較大，采用評分法［18］（7分制）對其甜味、苦味、酸味、鮮味、醇厚感和持續(xù)感進行評價，以2 g/100 mL麥芽糊精代替樣品溶液作為對照組［19］。評定標準為：1分（非常弱）、2分（很弱）、3分（對照組）、4分（一般）、5分（稍強）、6分（比較強）、7分（很強）。中性蛋白酶與復合風味蛋白酶添加比例的確定采用排序檢驗法［18］，鮮味越強，秩和數越小。感官評定結果取8 人評定結果的平均值。

2　結果與分析

2.1蛋白酶的選擇

不同的酶作用位點不同，水解蛋白的產物有所差異，進而呈現出不同的風味特點［19］。選取了堿性蛋白酶、復合風味蛋白酶、復合蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶這5 種酶進行水解。

圖1　5種蛋白酶水解四角蛤蜊肉過程中水解度的變化Fig.1　Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis by five different enzymes

圖2　5種酶解液感官得分Fig.2　Sensory evaluation scores of M. quadrangularis hydrolysates by five different enzymes

由圖1可知，這5 種酶的水解度都隨時間的延長而增大。8 h后，這幾種酶水解度增長的幅度變小。水解前5 h，堿性蛋白酶的水解效果最好，其次為木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶、復合風味蛋白酶。水解5～12 h，中性蛋白酶的水解效果最好。由圖2可知，復合風味蛋白酶酶解液的鮮味、甜味、持續(xù)感和醇厚感的評分都最高，酸味和苦味都最低；復合蛋白酶酶解液的鮮味和醇厚味也較高，甜味和持續(xù)感較復合風味蛋白酶低，苦味略高于復合風味蛋白酶酶解液；中性蛋白酶酶解液鮮味比木瓜蛋白酶酶解液的鮮味略低，但比木瓜堿性蛋白酶酶解液的苦味輕，醇厚感強；堿性蛋白酶酶解液的苦味最重，醇厚感與持續(xù)感也沒有其他4 種酶解液強烈。

結合各個酶的水解度，將中性蛋白酶與復合風味蛋白酶進行復配與復合蛋白酶進一步進行比較，在酶解料液比1∶2、溫度45 ℃、時間3 h、自然pH值、酶添加量3‰的基本酶解條件下，所得兩種酶復配的酶解液風味略優(yōu)于復合蛋白酶解液，所以最終選定中性蛋白酶和復合風味蛋白酶復配水解四角蛤蜊肉。

2.2 中性蛋白酶與復合風味蛋白酶質量比對水解度的影響

在2.1節(jié)基本酶解條件下，中性蛋白酶和復合風味蛋白酶復配質量比對水解度的影響如圖3所示。

圖3　中性蛋白酶與復合風味蛋白酶質量比對水解度的影響Fig.3　Effect of ratio of neutral protease to flavourzyme on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis

表2　不同復配質量比酶解液的鮮度感官評分Table2　Sensory score of M. quadrangularriiss hydrolysates by different ratios of neutral protease to flavourzyme

由圖3可知，中性蛋白酶與復合風味蛋白酶質量比為2∶1時，水解度最大。由表2可知，當這兩種酶的比例為2∶1時，秩和數最小，即鮮味最強。綜合水解度和鮮度感官評分結果，最終確定中性蛋白酶與復合風味蛋白酶質量比為2∶1。

2.3時間對水解度的影響

圖4　時間對水解度的影響Fig.4　Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis

酶對底物的作用需要一定的時間，在一定時間范圍隨著酶解時間的延長水解度增加。由圖4可知，在1～6 h內，隨著時間的延長，水解度快速增加，隨后水解度增加的比較緩慢。一方面可能是隨著時間的延長，體系的pH值發(fā)生改變，酶活力逐漸下降［20］，另一方面可能是游離的小肽和氨基酸增多，產物的抑制作用逐漸增強所致［9］。這與文獻中報道的中性蛋白酶［21］和復合風味蛋白酶［22］各自的水解趨勢相一致。綜合考慮，選擇6 h為水解時間。

2.4溫度對水解度的影響

圖5　溫度對水解度的影響Fig.5　Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis

溫度高低不僅影響蛋白酶的穩(wěn)定性，還影響蛋白酶催化反應速率［23］。由圖5可知，隨著溫度的升高，水解度逐漸增大，當水解溫度為50 ℃時，水解度最大。當溫度超過50 ℃，水解度逐漸下降，這可能是因為蛋白酶分子的肽鍵具有特定的空間結構，溫度超過一定限度后引起次級鍵解離從而致使蛋白酶喪失或部分喪失催化活性［9，23］。當溫度過低時則可能會大大降低體系內分子運動的激烈程度從而降低蛋白酶分子與底物的碰撞幾率［24］。因此，選擇復配的兩種酶的最適溫度為50 ℃。

2.5初始pH值對水解度的影響

圖6　初始pH值對水解度的影響Fig.6　Effect of initial pH value on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis

pH值可以影響蛋白分子的折疊情況，從而影響酶活力的大小。由圖6可知，在初始pH 4～8范圍內，水解度隨著pH值的升高呈現先上升后下降的趨勢。當pH 7時，水解度達到最大，當初始pH值呈弱堿性時，水解度逐漸降低。由此可知，pH值在趨于中性范圍內，水解度較大，因此選擇初始pH值為7。

2.6酶添加量對水解度的影響

由圖7可知，在選定的酶添加量范圍內，隨著酶添加量的增加，水解度也增大。酶添加量在0.3‰～2.1‰范圍內，水解度增加幅度比較大，酶添加量超過2.1‰，水解度增加幅度較小，從經濟效益方面考慮，選擇2.1‰為酶添加量。

圖7　酶添加量對水解度的影響Fig.7　Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis

2.7料液比對水解度的影響

圖8　料液比對水解度的影響Fig.8　Effect of material-to-liquid ratio on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis

由圖8可知，在選定的料液比范圍內，隨著料液比的減小，水解度呈現先增大后下降的趨勢。當料液比1∶4時，水解度達到最大。料液比主要影響底物的質量濃度，當底物質量濃度較大時，溶質的流動性變差，酶與底物不能充分結合，限制了反應的進行，當底物質量濃度逐漸減小時，溶質流動性變大，水解度也逐漸變大［23］。當底物濃度減小到一定程度時，酶與底物接觸的幾率變小，水解度降低［25］。同時考慮到液料比較小時，增加了水的成本和后續(xù)加工的負擔［26］，因此選擇1∶4為最適料液比。

2.8Box-Behnken響應面試驗結果

響應面試驗結果見表3。由表4可知，模型P＜0.000 1，模型達到極顯著。失擬項P=0.081 1＞0.05不顯著，因此二次模型成立，應用此模型可以預測水解度及優(yōu)化酶解工藝。影響水解度的主次因素為酶添加量＞時間＞溫度＞初始pH值，酶添加量對水解度的影響達到極顯著水平，溫度和時間對水解度的影響達到顯著水平。4 個因素中，溫度和時間、酶添加量和初始pH值交互作用極顯著，交互作用響應面圖及等高線圖見圖9。模型的回歸系數R2大于0.8時，模型才具有很好的擬合性，用以解釋數據變化和各參數間的關系［27］。由表5可知，預測二次模型的決定系數為0.911 7，表明模型與實際情況之間具有很好的擬合性。

表3　響應面試驗設計與結果Table3　Program and experimental results of RSM

表4　響應面二次模型方差分析Table4　Analysis of variance of response surface quadratic model

圖9　溫度和時間、初始pH值和酶添加量交互作用對四角蛤蜊水解度影響的響應面和等高圖Fig.9　Response surface and contour plot for the effect of hydrolysis temperature and times， and enzyme dosage and initial pH value on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis

響應面的圖形是響應值對各因子所構成的一個三維空間曲面圖，從響應面分析圖中可以找出最佳參數以及各參數之間的相互作用［5］。由圖9a可知，在一定范圍內，隨著時間的延長，水解度逐漸增大。隨著溫度的升高，水解度呈現先升高后下降的趨勢，這說明酶解的溫度不可以太高，否則影響酶的活力。這與單因素試驗結果相符。由圖9b可知，在一定范圍內，隨著酶添加量的增大，水解度逐漸增大。隨著初始pH值的升高，水解度呈現先升高后下降的趨勢。這與單因素試驗結果相符。

2.9響應面優(yōu)化四角蛤蜊肉酶解的最佳工藝條件

利用響應面優(yōu)化得到四角蛤蜊肉的最佳工藝條件為溫度52.10 ℃、時間5.55 h、pH 7.5、酶添加量2.4‰，水解度為45.68%。為便于生產化操作，將酶解條件設為溫度52 ℃、時間5.5 h、自然pH值、酶添加量2.4‰，最終由Design-Expert 8.0軟件優(yōu)化分析得水解度為44.58%，與上述酶解條件下得到的水解度差距不大。在此條件下，重復實驗3 次，所得酶解液的水解度為44.32%，與軟件優(yōu)化結果差距不顯著。因此選用溫度52 ℃、時間5.5 h、自然pH值、酶添加量2.4‰為最終的酶解條件。

3　結 論

以水解度和感官評價為指標，從堿性蛋白酶、復合風味蛋白酶、復合蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶這5 種酶選出中性蛋白酶和復合風味蛋白酶進行復配。在單因素試驗基礎上，以水解度為指標，選取酶解溫度、時間、初始pH和酶添加量4 個因素，根據Box-Behnken設計原理，建立了四因素三水平的響應面模型。利用響應面優(yōu)化并結合生產化操作，當溫度52 ℃、時間5.5 h、自然pH值、酶添加量2.4‰時，酶解液水解度理論預測值較高，為44.58%，實際值為44.32%，與預測值相吻合。綜上所述，雙酶復合酶解最佳工藝條件為中性蛋白酶和復合風味蛋白酶質量比2∶1、酶添加量2.4‰、時間5.5 h、溫度52 ℃、料液比1∶4、自然pH值，此時酶解液的水解度較大，風味較好。

采用生物酶解技術將四角蛤蜊肉中的蛋白質分解為氨基酸和肽，制備海鮮調味料風味前體物質，生產工藝簡單，便于大規(guī)模工廠化生產，且反應條件溫和，不存在安全隱患。以此酶解液為基礎，可進一步通過調配或再與還原糖類物質發(fā)生熱反應來制備海鮮調味料，使產品兼具濃郁海鮮風味和營養(yǎng)功能，應用前景廣闊，可為四角蛤蜊的深加工提供方法借鑒。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysiss of Mactra quadrangularis to Prepare Seasoning Flavor Precursors by Response Surface Methodology

GAO Junhuan1， LI Xuepeng1，*， LIU Yu1， YI Shumin1， LI Jianrong1，*， LI Yujin2， LIN Hong3
（1. Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province， Research Institute of Food Science， Bohai University， Jinzhou 121013， China；2. Taixiang Group， Shandong Institute of Marine Food Nutrition， Rongcheng 264303， China；3. College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao 266003， China）

In this study， the enzymatic hydrolysis of fresh Mactra quadrangularis meat to prepare seasoning flavor precursors was optimized for improved degree of hydrolysis and sensory evaluation of hydrolysates by the combined use of single factor experiments and Box-Behnken response surface methodology. A combination of neutral protease and flavourzyme at a mass ratio of 2：1 was found to be optimal for the hydrolysis of Mactra quadrangularis meat based on degree of hydrolysis and sensory evaluation of hydrolysates. The optimal hydrolysis conditions were further determined as follows： enzyme dosage， 2.4‰； hydrolysis time， 5.5 h； hydrolysis temperature， 52 ℃； material-to-liquid ratio， 1：4； and natural pH. Under these conditions， the enzymatic hydrolysate indicated a higher degree of hydrolysis and a better flavor.

Mactra quadrangularis； enzymatic hydrolysis； degree of hydrolysis； seafood condiment

TS254.9

A

1002-6630（2015）14-0017-07

10.7506/spkx1002-6630-201514004

2014-12-08

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD29B06）

高郡煥（1989—），女，碩士研究生，研究方向為水產品貯藏加工。E-mail：970237847@qq.com

李學鵬（1982—），男，副教授，博士，研究方向為水產品貯藏加工。E-mail：xuepengli8234@163.com勵建榮（1964—），男，教授，博士，研究方向為水產品貯藏加工與食品安全。E-mail：lijr6491@163.com