王玉濤，招穗珊，關(guān)文達(dá)，李潤(rùn)峰，楊子峰，王新華

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510230 2.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州510182

白藜蘆醇對(duì)常見(jiàn)腸道病毒抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

王玉濤1，招穗珊2，關(guān)文達(dá)1，李潤(rùn)峰1，楊子峰1，王新華2

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510230 2.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州510182

目的：觀察白藜蘆醇體外對(duì)多種腸道病毒的抑制藥效，為進(jìn)一步探討其抗腸道病毒譜提供依據(jù)。方法：采用細(xì)胞病變抑制法（Cytopathic effect inhibition Assay，CPE）和四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法，通過(guò)計(jì)算病毒抑制率、藥物半數(shù)有效濃度（IC50）及選擇指數(shù)（selection index，SI），研究白藜蘆醇體外對(duì)抗多種腸道病毒的作用效果。結(jié)果：腸道病毒屬（EV）11、EV71、EV84、柯薩奇病毒（COX）B3和COX A10等5種病毒的TCID50分別為：2.13×10-4，1×10-4，2.13×10-6，1×10-5及4.67×10-4。白藜蘆醇在Vero E6細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC50為50μg/mL。白藜蘆醇最大無(wú)毒濃度為25μg/mL，以此為抗病毒活性檢測(cè)的起始濃度。在最大無(wú)毒濃度下，白藜蘆醇與陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)5種腸道病毒均有抑制作用。除EV84病毒外，白藜蘆醇的抑制率均高于陽(yáng)性藥物利巴韋林。結(jié)論：白藜蘆醇體外具有抗多種腸道病毒作用，對(duì)于病毒性腸道傳染病防治具有一定應(yīng)用前景。

白藜蘆醇；腸道病毒；體外試驗(yàn)

腸道病毒屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）中的腸道病毒屬（Enterovorus，EV），人類是腸道病毒唯一的天然宿主，主要通過(guò)糞口途徑傳播［1～2］。臨床癥狀輕者表現(xiàn)為倦怠、乏力、低熱等，重者可全身感染，腦、脊髓、心、肝等重要器官受損，預(yù)后較差，并可遺留后遺癥或造成死亡，特別是嬰幼兒患者可以爆發(fā)嚴(yán)重的腦炎、心肌炎或重癥肺炎［3～5］。目前臨床尚無(wú)有效抗腸道病毒藥物，進(jìn)行臨床研究的普來(lái)可那立是代謝穩(wěn)定的病毒衣殼功能抑制劑，具有廣譜的抗腸道病毒和鼻病毒活性，并且口服效果較好，但由于不良反應(yīng)，尚未獲得批準(zhǔn)［2］。

白藜蘆醇（resveratrol），化學(xué)名稱為3，4’，5-三羥基-二苯乙烯，是一種植物抗毒素，目前至少已經(jīng)在21個(gè)科、31個(gè)屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇，包括決明、葡萄，花生、虎杖等［6～8］。近年研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有多種生物學(xué)活性，包括抗炎、抗細(xì)菌和真菌、抗血小板凝集、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保護(hù)心血管、抗腫瘤、抗肝炎病毒、單純皰疹病毒和EB病毒等作用［9～10］，尤其是，白藜蘆醇的抗病毒作用受到廣泛關(guān)注，一直是其生物活性研究的熱點(diǎn)之一。本課題組前期已發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)于可引起呼吸道和消化道感染的腺病毒具有較好效果［11］，為了進(jìn)一步探討其對(duì)腸道病毒的抑制作用，本研究選擇了EV11、EV71、EV84、柯薩奇病毒（Coxsackievirus，COX）B3和A10為觀察對(duì)象，研究白藜蘆醇的體外抗腸道病毒作用，為該類病毒的臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 白藜蘆醇（粉末狀，純度為98.55%，購(gòu)自西安冠宇生物技術(shù)有限公司）。利巴韋林，購(gòu)自廣州肇慶星湖醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：L071015。

1.2 毒株與細(xì)胞 腸道病毒（EV11、EV71、EV84、COX B3、COX A10）等均為呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室病毒室臨床分離株，經(jīng)特異性引物擴(kuò)增測(cè)序鑒定。上述毒株于Vero E6細(xì)胞傳代，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，以細(xì)胞病變法計(jì)算半數(shù)感染量（TCID50）。常規(guī)CPE法測(cè)定5種腸道病毒EV11、EV71、EV84、COX B3和COX A10病毒對(duì)Vero E6細(xì)胞的病毒半數(shù)感染劑量（TCID50）［11］。

1.3 白藜蘆醇的細(xì)胞毒性試驗(yàn) 按每孔約2.5×104VeroE6細(xì)胞接種到96孔板，24～36 h后待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，棄去培養(yǎng)液，加入不同稀釋度（2倍）的藥物100μL/孔，空白對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照孔加入100μL/孔MEM，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加MTT溶液（5 mg/m L）20μL，置37℃，5% CO2溫箱中繼續(xù)孵育4 h。吸棄上清液，每孔加100μL二甲基亞砜（DMSO），低速振蕩10m in，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值。按照用Reed-Muench法［12］計(jì)算藥物半數(shù)有毒濃度（TC50）。

1.4 白藜蘆醇的體外抗腸道病毒藥效96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的Vero E6細(xì)胞先孵育腸道病毒（EV11、EV71、EV84、COX B3和COXA10）2 h，同時(shí)設(shè)定陽(yáng)性藥物（利巴韋林）和細(xì)胞對(duì)照，在最大無(wú)毒濃度條件下，加入不同濃度藥物（除陽(yáng)性和陰性對(duì)照外）在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變（CPE）并記錄。試驗(yàn)時(shí)設(shè)陽(yáng)性藥物對(duì)照、正常細(xì)胞對(duì)照及病毒對(duì)照。細(xì)胞出現(xiàn)病變程度按以下6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄：-為細(xì)胞生長(zhǎng)正常，無(wú)病變出現(xiàn)；±為細(xì)胞病變少于整個(gè)單層細(xì)胞的10%；+為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的25%；++為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的50%；+++為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%；++++為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以上［13］。當(dāng)病毒對(duì)照組CPE為+++～++++時(shí)，用M TT法測(cè)定所有組的細(xì)胞存活數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)公式［12］計(jì)算白藜蘆醇對(duì)5種腸道病毒的抑制率。病毒抑制率=（試驗(yàn)組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值）/（細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值）×100%［14］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)，用藥物組吸光度與對(duì)照組吸光度作單因素方差分析。

2 研究結(jié)果

2.1 病毒TCID50測(cè)定結(jié)果EV11、EV71、EV84、COX B3和COX A10等5種病毒的TCID50分別為：2.13×10-4，1×10-4，2.13×10-6，1×10-5及4.67×10-4。

2.2 白藜蘆醇的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果 白藜蘆醇在Vero E6細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度TC50為50μg/m L。白藜蘆醇最大無(wú)毒濃度為25μg/m L，以此為抗病毒活性檢測(cè)的起始濃度。

2.3 白藜蘆醇體外抗腸道病毒藥效比較 見(jiàn)表1、表2。在最大無(wú)毒濃度下，白藜蘆醇與陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)5種腸道病毒均有抑制作用。除EV84病毒外，白藜蘆醇的抑制率均高于陽(yáng)性藥物利巴韋林。

表1 白藜蘆醇體外抗腸道病毒藥效比較

表2 白藜蘆醇對(duì)常見(jiàn)腸道病毒致病變半數(shù)有效濃度（IC50）及選擇指數(shù)（SI）比較

3 討論

腸道病毒所含血清型眾多，是引起手足口病的主要病原體，包括EV71（Enterovirus71），COX A組和B組，其中EV71可引起神經(jīng)系統(tǒng)方面的并發(fā)癥，且病情較重［15］，而COX可引起急、慢性心肌炎，少數(shù)病人有進(jìn)行性心衰、心率失常等表現(xiàn)［16］，對(duì)人類健康產(chǎn)生重大影響。由于目前臨床并無(wú)有效疫苗或藥物，研發(fā)相關(guān)的抗病毒藥物極其迫切。

傳統(tǒng)植物藥材應(yīng)用廣泛且歷史悠久，為抗病毒藥物開(kāi)發(fā)提供了重要資源，從中發(fā)現(xiàn)挖掘新型有效的抗病毒藥物具有重要意義和價(jià)值，同時(shí)對(duì)于解決化學(xué)藥物引起的耐藥性和副作用提供了新的選擇。白藜蘆醇，1940年由日本學(xué)者從毛葉蘆藜的根部提取到［7］，是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類化合物，目前已在多種植物中發(fā)現(xiàn)，有報(bào)道其對(duì)流感病毒有較好的抑制作用，主要機(jī)理是通過(guò)干預(yù)流感病毒vRNP在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間轉(zhuǎn)移以及抑制宿主細(xì)胞protein kinase C（PKC）活性及其依賴的相關(guān)通路而發(fā)揮抗病毒作用，體內(nèi)藥效顯示其可有效改善感染流感病毒小鼠的存活率以及降低肺組織病毒滴度［17］。

本實(shí)驗(yàn)初步探討了白藜蘆醇體外對(duì)多種常見(jiàn)腸道病毒的活性，證實(shí)白藜蘆醇在Vero細(xì)胞中有一定的抗腸道病毒的活性，其中在25μg/m L濃度下，對(duì)EV71、COXB3、COXA10的病變抑制率均達(dá)到96%以上，具有一定的廣譜性，尤其是在目前缺乏抗腸道病毒藥物的條件下，為白藜蘆醇作為候選藥物用于抗腸道病毒的研究提供一定的理論支持。下一步將繼續(xù)研究其抗腸道病毒的藥理機(jī)制，對(duì)不同腸道病毒藥效差異性及是否存在相同的機(jī)理，以及該藥物對(duì)宿主細(xì)胞是否也有一定的影響，包括各種宿主細(xì)胞通路等，從而較完整的闡明白藜蘆醇的抗病毒活性和特點(diǎn)。

［1］陳敬賢.診斷病毒學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

［2］陳敬賢，周榮，彭濤，等.臨床病毒學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2012.

［3］Sawyer MH.Enterovirus infections：diagnosis and treatment［J］.Semin Pediatr Infect Dis，2002，13（1）：40-47.

［4］Ang LW，Koh BK，Chan KP，et al.Epidemiology and control of hand，foot and mouth disease in Singapore，2001-2007［J］.Ann Acad Med Singapore，2009，38（2）：106-112.

［5］Yen FB，Chang LY，Kao CL，et al.Coxsackie viruses infection in northern Taiwan epidemiology and clinnical characteristics［J］.J Microbiol Immunol Infect，2009，42（1）：38-46.

［6］孟雪蓮，楊靜玉，吳春福.白藜蘆醇的藥理學(xué)作用研究進(jìn)展［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25（5）：52-54.

［7］周福成，周艷琴，郭婷婷，等.白藜蘆醇的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，6（8）：11-13.

［8］王沖，華子春.白藜蘆醇的免疫調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2012，33（1）：84-87.

［9］張梅，楊林.白藜蘆醇生物學(xué)作用的研究進(jìn)展［J］.華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，9（3）：333-335.

［10］Kapadia GJ，Azuine MA，Tokuda H，et al.Chemopreventive effect of resveratrol，sesamol，sesame oil and sunflower oil in the Epstein-Barr virus early antigen activation assay and the m ouse skin tw o-stage carcinogenesis［J］.Pharmacol Res，2002，45（6）：499-505.

［11］關(guān)文達(dá)，楊子峰，劉妮，等.白藜蘆醇對(duì)多種呼吸道病毒作用體外實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥材，2008，31（9）：1388-1390.

［12］Reed LJ，Muench H.A simple method of estimating fifty percent endpoints［J］.Am J Hyg，1938，27（3）：493-497.

［13］田新貴，李翔，周榮，等.利巴韋林對(duì)腸道病毒體外抑制作用的研究［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2009，9（2）：1388-1390.

［14］劉媛媛，楊占秋，何靜，等.MTT分析法、空斑減數(shù)法及CPE觀察法評(píng)估藥物體外抗病毒效果的比較與分析［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2005，26（2）：199-202.

［15］周伯平，李成榮.腸道病毒71型手足口?。跰］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009.

［16］幸建華，楊占秋.柯薩奇病毒與病毒性心肌炎［J］.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜，2004，17（3）：260-261.

［17］Anna T.Palamara，Lucia Nencioni，Katia Aquilano，et al.Inhibition of influenza A virus replication by resveratrol［J］.The Journal of Infectious Diseases，2005，191：1719-1929.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

R285.5

A

0256-7415（2015）02-0222-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.104

2014-09-15

國(guó)家自然科學(xué)基金-廣東聯(lián)合基金項(xiàng)目（U1201227）；廣州市教育系統(tǒng)創(chuàng)新學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（13C07）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目-科技惠民專項(xiàng)項(xiàng)目（2014Y2-00031）；廣州市健康醫(yī)療協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)項(xiàng)目（201400000002）

王玉濤（1981-），男，助理研究員，研究方向：中藥抗病毒。

王新華，E－mail：xinhuaw@gzhmu.edu.cn。