王真，施新顏，陳宇

（杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院　檢驗(yàn)科，浙江　杭州　310008）

·技術(shù)與方法·

紅藍(lán)熒光細(xì)胞的構(gòu)建

王真，施新顏，陳宇

（杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江杭州310008）

目的：構(gòu)建人組蛋白H2B基因與藍(lán)色熒光蛋白（BFP）融合的真核表達(dá)質(zhì)粒，使其能在黑色素瘤細(xì)胞（B16細(xì)胞）中表達(dá)，形成在核區(qū)可以發(fā)出肉眼可見的藍(lán)色熒光，胞質(zhì)區(qū)發(fā)出肉眼可見紅色熒光的雙色熒光細(xì)胞。方法：采用普通PCR擴(kuò)增得到BFP序列，通過反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）從含有腺病毒E1A基因的人腎上皮細(xì)胞（293細(xì)胞）中擴(kuò)增獲得H2B基因的部分cDNA序列。將BFP序列、H2B基因與pRetroX-Tight-Pur載體質(zhì)粒來構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒（pRetroX-BFP-H2B），對(duì)其進(jìn)行酶切并用普通PCR方法進(jìn)行鑒定。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞質(zhì)中能表達(dá)紅色熒光蛋白（RFP）的B16細(xì)胞并觀察融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果：成功構(gòu)建pRetroX-BFP-H2B質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)染后的雙熒光細(xì)胞可以呈現(xiàn)出雙熒光的效果，轉(zhuǎn)染后也能穩(wěn)定地表達(dá)傳代。結(jié)論：本研究為雙色熒光細(xì)胞的構(gòu)建及其熒光蛋白種類的選用提供了新的參考。

H2B基因；藍(lán)色熒光蛋白；黑色素瘤細(xì)胞；真核表達(dá)質(zhì)粒

熒光蛋白在生物感應(yīng)器中的巨大應(yīng)用潛力逐漸被開發(fā)出來。利用細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成信息開發(fā)出來的探針可以不斷提高生物感應(yīng)器的敏感度。目前利用熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞核染色體并跟蹤觀察的技術(shù)已經(jīng)比較成熟，熒光標(biāo)記技術(shù)的成功標(biāo)志著大部分的生物參數(shù)可以采用以熒光蛋白為基礎(chǔ)的生物感應(yīng)器進(jìn)行測(cè)量。故本研究希望通過探索紅藍(lán)熒光細(xì)胞的構(gòu)建，為細(xì)胞熒光定位設(shè)計(jì)提供新的思路。

1　材料和方法

1.1材料 pRetroX-Tight-Pur載體質(zhì)粒、PAAV3質(zhì)粒、黑色素瘤細(xì)胞（B16細(xì)胞）、人腎上皮細(xì)胞（293細(xì)胞）、H5α菌種（均由中國(guó)疾病控制中心病毒病所提供）；限制性內(nèi)切酶Mlu1、EcoR1、BamH1，T4 DNA連接酶，Pyrobest DNA聚合酶，rTaq DNA聚合酶（均由TaKaRa公司提供）；質(zhì)粒小提試劑盒（由天根生化科技有限公司提供）；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（由天根生化科技有限公司提供）；RNAisoTM Plus試劑盒（由TaKaRa公司提供）；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2（由TaKaRa公司提供）；胎牛血清（由杭州四季青生物工程材料有限公司提供）；Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM（由美國(guó)GIBCO/BRL公司提供）；氨芐青霉素（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供）；LD12000 DNA Marker LD12000（由TaKaRa公司提供），核酸染料（由北京博潤(rùn)萊特科技有限公司提供）；溴酚藍(lán)指示劑（由TaKaRa公司提供）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1藍(lán)色熒光蛋白（BFP）基因的提取與處理：①BFP基因的提?。簱u床設(shè)置37 ℃ 220 r/min，挑取含PAAV3質(zhì)粒（含BFP基因）的單克隆菌落置于2 mL LB液體培養(yǎng)基中，于搖床中振蕩培養(yǎng)過夜，按照質(zhì)粒小提試劑盒中說明書的方法提取該單克隆菌落中的PAAV3質(zhì)粒。將提取后的PAAV3質(zhì)粒進(jìn)行普通PCR，以獲得兩端具有Mlu1與EcoR1兩個(gè)酶切位點(diǎn)的BFP基因片段。獲得目的條帶大小應(yīng)為742 bp，通過凝膠電泳觀察其大小及亮度。引物序列為：

②BFP基因片段的酶切：通過普通PCR擴(kuò)增獲得的BFP的DNA片段，先用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒將其純化，然后在Mlu1和EcoR1雙酶切作用下，置于37 ℃水浴中過夜。酶切結(jié)束后，通過凝膠電泳觀察片段的亮度與大小。

1.2.2pRetroX-Tight-Pur載體質(zhì)粒的提?。孩賞RetroX-Tight-Pur載體質(zhì)粒的提?。涸O(shè)置搖床37 ℃220 r/min，挑取含pRetroX-Tight-Pur載體質(zhì)粒的單克隆菌落于2 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中振蕩培養(yǎng)過夜，將菌液分裝于4個(gè)EP管，按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書中的方法提取pRetroX-Tight-Pur載體質(zhì)粒。載體質(zhì)粒大小為6 568 bp，凝膠電泳觀察其大小及亮度。②pRetroX-Tight-Pur載體質(zhì)粒的酶切：由于該質(zhì)粒中Mlu1和EcoR1的酶切位點(diǎn)相鄰，所以先用MIu1酶切2 h后，經(jīng)電泳鑒定已大致酶切完全，再加入EcoR1酶切，于37 ℃水浴中過夜。酶切后進(jìn)行凝膠電泳，并觀察載體質(zhì)粒DNA的大小與亮度。

1.2.3BFP基因的插入：將酶切獲得的BFP基因片段與pRetroX-Tight-Pur載體質(zhì)粒分別用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化。然后通過對(duì)BFP基因片段與pRetroX-Tight-Pur載體質(zhì)粒大小及相應(yīng)濃度的估計(jì)，調(diào)整載體與目的片段的量使其在酶切與連接體系中的濃度比在1∶3～1∶10之間，使用T4連接酶于16 ℃水浴并對(duì)其連接過夜。

1.2.4pRetroX-BFP重組質(zhì)粒的鑒定：①pRetroXBFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌：將pRetroX-BFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌H5α。②單克隆菌落的挑取與培養(yǎng)：次日觀察平板，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)有約50～60株菌落，挑取10株形狀規(guī)則的菌落分別置于含氨芐青霉素的2 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，并標(biāo)記為1～10號(hào)，置于37 ℃ 220 r/min搖床上培養(yǎng)16 h。③pRetroX-BFP重組質(zhì)粒的提取與鑒定：按照質(zhì)粒小提試劑盒提取pRetroX-BFP重組質(zhì)粒的DNA，取1 μL DNA稀釋成30 μL溶液進(jìn)行普通PCR鑒定，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后觀察，挑選陽性株。④重組子的酶切鑒定：將各管提取的質(zhì)粒溶液置于37 ℃水浴中，并用MIu1 和EcoR1雙酶切2.5 h，再進(jìn)行電泳觀察其酶切結(jié)果。根據(jù)普通PCR和酶切結(jié)果的鑒定，挑選質(zhì)粒重組成功的菌株，將該菌種與含60%甘油的凍存液600 μL 以1∶1的比例保種。

1.2.5人組蛋白H2B基因的cDNA制備：①B16細(xì)胞RNA的提?。喊凑誖NAisoTM Plus試劑盒說明書中的方法提取B16細(xì)胞中的總RNA，室溫干燥沉淀2～5 min（不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會(huì)很難溶解），加入適量的RNase-free水溶解沉淀，必要時(shí)可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后置于-80 ℃冰箱保存。②H2B核定位信號(hào)的cDNA制備：采用PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver 2試劑盒將以上提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR），引物序列為：

RT-PCR結(jié)束后，采用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化DNA片段，獲得的基因兩端酶切位點(diǎn)為Mlu1與BamH1，取2 μL進(jìn)行電泳并觀察結(jié)果，獲得目的基因大小應(yīng)為400 bp左右，濃度約為10 ng/μL。取約2 μg純化后的H2B DNA片段，在37 ℃水浴中用Mlu1 和BamH1雙酶切過夜，通過凝膠電泳觀察酶切后DNA片段的亮度。

1.2.6pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒的制備：①pRetroXBFP載體質(zhì)粒的酶切處理：取約2 μg已構(gòu)建的pRetroXBFP載體質(zhì)粒，在37 ℃水浴中用Mlu1和BamH1雙酶切過夜。用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)酶切后的pRetroX-BFP載體質(zhì)粒進(jìn)行純化，再取2 μL純化后質(zhì)粒進(jìn)行凝膠電泳并觀察質(zhì)粒亮度。②pRetroX-BFPH2B重組質(zhì)粒的制備：根據(jù)凝膠電泳中的質(zhì)粒亮度估算質(zhì)粒濃度，調(diào)整載體質(zhì)粒與H2B DNA片段在酶切與連接體系中的終濃度比。為能得到較好的重組結(jié)果，將酶切后得到的H2B cDNA與BFP-pRetroX在20 ℃水浴中連接2.5 h。

1.2.7pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒的鑒定：①單克隆挑取與鑒定：將重組子轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，并均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基，在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日觀察，菌落約70個(gè)。挑取9個(gè)菌落于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，并分別標(biāo)號(hào)1～9號(hào)，置于37 ℃ 220 r/min的搖床培養(yǎng)3.5 h。分別吸取2 μL菌液進(jìn)行普通PCR反應(yīng)進(jìn)行鑒定，并以等量的ddH2O與H2B cDNA作對(duì)照，再通過凝膠電泳觀察結(jié)果。②酶切鑒定：將凝膠電泳中條帶明亮清晰的菌株，加入含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 220 r/min的搖床培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的菌液用質(zhì)粒小提試劑盒提取DNA質(zhì)粒，加入EcoR1與BamH1酶于37 ℃水浴1.5 h，同時(shí)用pRetroX-BFP作為對(duì)照，酶切結(jié)束后通過凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.2.8pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒的大量制備：采用QIANGEN質(zhì)粒提取試劑盒并按照其說明書中的方法大量制備pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒，提取獲得的質(zhì)粒經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)值后得到的數(shù)據(jù)為：濃度為0.078 μg/μL，260/280=1.82，260/230=2.05。

1.2.9轉(zhuǎn)染：選用細(xì)胞質(zhì)中能表達(dá)紅色熒光蛋白（RFP）的B16細(xì)胞，采用脂質(zhì)體法將pRetroX-BFPH2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至B16細(xì)胞中。

1.2.10嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基的配置：取嘌呤霉素鹽酸鹽（規(guī)格為25 mg），用5 mL去離子水完全溶解后過濾除菌，分裝至EP管。取200 μL嘌呤霉素鹽酸鹽溶液，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配置成篩選培養(yǎng)基母液1 mL，濃度為1.0 mg/mL。取3只EP管中各加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，再分別加入1.0 mg/mL的培養(yǎng)基母液10、15和20 μL，配成嘌呤霉素終濃度為1.0、1.5和2.0 μg/mL的篩選培養(yǎng)基，用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選。

1.2.11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選：用1.0、1.5和2.0 μg/mL的3個(gè)濃度的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)被質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在第10～第15天內(nèi)細(xì)胞全部死亡的最低濃度為1.0 μg/mL，選擇該濃度為篩選培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞大量死亡時(shí)撤去篩選培養(yǎng)基改用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)期間定期用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光效果。

2　結(jié)果

2.1pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞的熒光激發(fā)結(jié)果 B16細(xì)胞經(jīng)pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h以后，在熒光顯微鏡下觀察其結(jié)果。如圖1所示，在紫光激發(fā)下，對(duì)照組細(xì)胞（pRetroX-BFPH2B重組質(zhì)粒未轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞）中有隱約的紅色熒光，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞）中可以觀察到藍(lán)色熒光與暗紅色熒光。

圖1　pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞72 h后的熒光激發(fā)圖（×400）

用1.0 μg/mL的嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基篩選對(duì)照組細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞6 d后，在熒光顯微鏡下用紫光及綠光激發(fā)并觀察其結(jié)果。如圖2所示，在紫光激發(fā)下，對(duì)照組細(xì)胞中有較多細(xì)胞死亡，大多數(shù)死亡細(xì)胞呈球形漂浮于培養(yǎng)基中并無藍(lán)色熒光，少部分細(xì)胞仍表現(xiàn)非特異性紅色熒光。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中可以觀察到大多數(shù)細(xì)胞的胞漿呈非特異性紅色熒光，細(xì)胞輪廓與形態(tài)清晰可見，而其中央?yún)^(qū)域則呈圓點(diǎn)狀的藍(lán)色熒光。在綠光激發(fā)下，對(duì)照組細(xì)胞中的死亡細(xì)胞依然能夠呈現(xiàn)紅色熒光，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞能呈現(xiàn)強(qiáng)紅色熒光，與紫光激發(fā)下的熒光效果對(duì)比強(qiáng)烈。

2.2各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞不同時(shí)間長(zhǎng)度的熒光結(jié)果 對(duì)照組細(xì)胞分別為：pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16（不含RFP）細(xì)胞、pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和PAAV2-EGFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。如圖3所示，pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16（不含RFP）細(xì)胞24 h，基本不可見熒光的激發(fā)，pRetroXBFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16（不含RFP）細(xì)胞96 h，已可見視野中有數(shù)量不少的藍(lán)色熒光，但亮度微弱。與pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞24 h和PAAV2-EGFP載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞24 h作為陽性對(duì)照相比，pRetroX-BFP-H2B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BFP在細(xì)菌中的表達(dá)量較差。

圖2　嘌呤霉素篩選細(xì)胞6 d后的熒光激發(fā)圖（×400）

圖3　各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞不同時(shí)間長(zhǎng)度的熒光激發(fā)圖（×400）

3　討論

熒光蛋白如綠色熒光蛋白（GFP）、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）、黃色熒光蛋白（YFP）、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）等的熒光效果好，在生物學(xué)研究中的采用都較為廣泛，而BFP的熒光亮度普遍都比較低，要求的激發(fā)光條件又比較高，因此其在生物學(xué)研究中的應(yīng)用比較少。本研究中選取的熒光蛋白為BFP和RFP，一是運(yùn)用紅色熒光與藍(lán)色熒光的顏色有較大的反差，以及兩者在對(duì)方激發(fā)光源下的非特異性激發(fā)效果低，方便對(duì)比觀察；二是BFP在標(biāo)記上的應(yīng)用較少。通過本研究可以進(jìn)一步了解BFP在實(shí)際應(yīng)用中的情況。

通過將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，可以見到藍(lán)色熒光在細(xì)胞質(zhì)中呈圓點(diǎn)狀分布，從而可以確定BFP和H2B基因已重組入表達(dá)載體，但是BFP是否只在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。通過10多天的轉(zhuǎn)染、細(xì)胞的篩選培養(yǎng)及觀察，得到真核表達(dá)載體能整合入真核細(xì)胞的染色體組中并形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，其重組后的基因并不容易隨著細(xì)胞的傳代而丟失。但是BFP熒光強(qiáng)度較弱，如何提高BFP的表達(dá)量或改善BFP的熒光強(qiáng)度并使其在科研中被更為廣泛的應(yīng)用是目前所必須解決的問題。

本研究將H2B融合BFP基因入核來構(gòu)建細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核表達(dá)不同顏色的雙色熒光蛋白細(xì)胞。該雙熒光細(xì)胞可以呈現(xiàn)出雙熒光的效果，轉(zhuǎn)染后也能穩(wěn)定地表達(dá)傳代，為細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核雙染色在細(xì)胞的生理、病理形態(tài)學(xué)變化觀察提供了一定的可借鑒方法，并為雙熒光細(xì)胞的構(gòu)建以及其熒光蛋白種類的選用提供了新的參考，為今后成熟地選用熒光蛋白標(biāo)記與熒光蛋白的定位做了初步的探索和準(zhǔn)備。

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（本文編輯：吳昔昔）

Construction of red and blue fluorescent cells

WANG Zhen， SHI Xinyan， CHEN Yu. Department of Clinical Laboratory， Hangzhou Women’s Hospital， Hangzhou， 310008

Objective: To construct the eukaryotic expression plasmid of BFP-H2B and express it in the B16 mouse melanoma cells which can already express red fluorescence protein （RFP） in the cytoplasm， and make the cells’ nucleus show blue light while the plasmid show red light when activated by suitable light wave. Methods: The blue fluorescence protein （BFP） was acquired with PCR from a constructed PAAV3， and H2B gene was obtained with RT-PCR from cultured 293 cell’s total RNA. The sequence encoding H2B and the sequence encoding BFP were inserted into pRetroX to construct the eukaryotic expression vector pRetroX-BFP-H2B. After the constructed plasmid was confirmed by enzymatic digestion and PCR digestion， the recombination plasmid was transfected into B16 mouse melanoma cells which could already express RFP in the cytoplasm by the lipofectamine transfection technology for observation of the fusion protein’s expression. Results: The transfection of double fluorescent cells could present a double fluorescent effect， and stably expresssd batches after successfully constructed the eukaryotic expression plasmid of BFP-H2B. It provided a new reference for the construction of double fluorescent cells and the selection of the fluorescent protein species. Conclusion: In this study we establish an available survey system for the study of the two color fluorescence cells and the selection of fluorescence proteins used.

gene H2B； blue fluorescence protein； melanoma cells； eukaryotic expression plasmid

Q78

B DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.009

2014-12-15

王真（1985-），女，山東日照人，檢驗(yàn)師，碩士。