賓冬梅，黃河清濤，伍渡清，易　誠，饒力群

（1.衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南衡陽 421008；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.燕京啤酒（衡陽）有限公司，湖南衡陽 421008）

啤酒糟發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件優(yōu)化研究

賓冬梅1，黃河清濤2，伍渡清3，易誠1，饒力群2

（1.衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南衡陽 421008；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；3.燕京啤酒（衡陽）有限公司，湖南衡陽 421008）

為優(yōu)化發(fā)酵條件，選擇黑曲霉及康氏木霉，以羧甲基纖維素酶活性為指標(biāo)，通過正交優(yōu)化試驗(yàn)，優(yōu)化單一菌種和混和菌種的最佳發(fā)酵條件，比較發(fā)酵結(jié)果。結(jié)果表明：黑曲霉在時(shí)間為3天，料水比1：1.5，接種量20%，溫度34℃的條件下發(fā)酵，測(cè)量結(jié)果為纖維素酶活為706.427 nkat；康氏木霉在時(shí)間為3天，料水比1：1.5，接種量30%，溫度34℃的條件下發(fā)酵，測(cè)量結(jié)果為纖維素酶活為459.230 nkat；混菌發(fā)酵中，料水比為1：0.5，混菌接種20%，其中黑曲霉比木霉接種量為6：4，在32℃下培養(yǎng)3天時(shí)，纖維素酶活為812.380 nkat。表明混菌發(fā)酵效果比單菌種發(fā)酵效果更好，所產(chǎn)生的纖維素酶活更高。

啤酒糟；混菌；發(fā)酵；纖維素酶

啤酒糟是生產(chǎn)啤酒的主要原料大米、麥芽等經(jīng)糊化、糖化工藝進(jìn)行過濾或壓濾之后殘留的固體物質(zhì)，主要成分包括蛋白質(zhì)、纖維組分、維生素、脂肪、礦物質(zhì)及淀粉［1］等，且含水量大，容易變質(zhì)。啤酒企業(yè)直接作為粗飼料銷售，因纖維含量高、適口性差，養(yǎng)殖戶不能完全接收［2-5］，不少企業(yè)作為廢棄物排放，不僅造成資源浪費(fèi)，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境污染［6］。所以實(shí)現(xiàn)提高啤酒糟的利用率，是具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)意義。

目前，國內(nèi)外產(chǎn)纖維素酶的主要菌種是曲酶、木霉等［7-11］，世界上纖維素酶市場(chǎng)中的纖維素酶20%是來自木霉屬和曲霉屬［12］。本文選擇黑曲霉和康氏木霉為菌種，以啤酒糟為基質(zhì)，考查單菌發(fā)酵與混菌發(fā)酵對(duì)羧甲基纖維素酶活性的影響，為實(shí)現(xiàn)提高啤酒糟的利用以及工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的需要提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種：黑曲霉、康氏木霉，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院實(shí)驗(yàn)室提供。

試劑：3，5-二硝基水楊酸（DNS），羧甲基纖維素鈉，硝酸鈉、葡萄糖、醋酸、苯酚、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

儀器：粗纖維測(cè)定儀、馬弗爐、恒溫培養(yǎng)箱；紫外分光光度計(jì)；恒溫水浴鍋；高溫滅菌鍋；離心機(jī)。

斜面（平板）培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂。

種子培養(yǎng)基：10%麩皮浸汁培養(yǎng)基（10g麩皮+ 100g水煮沸20min，過濾后稀釋到100m L）。

發(fā)酵培養(yǎng)基：250m L三角瓶中裝入經(jīng)處理的啤酒糟和麩皮共30g（采取啤酒槽與麩皮的比例為8∶2）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1種子制備

將大約150ml種子培養(yǎng)基放置于250ml三角瓶中，于115℃滅菌15min，冷卻后接入新鮮成熟黑曲霉（或康氏木霉）斜面孢子（培養(yǎng)約4d）一環(huán)，30℃、100r/min搖床中培養(yǎng)3d。

1.2.2 發(fā)酵方法

在250ml燒杯中加入發(fā)酵培養(yǎng)基30g，然后滅菌，再接入一定量的種子液，在一定溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間，在發(fā)酵結(jié)束后，稱取1g發(fā)酵產(chǎn)物，加入10ml 0.5mol/L醋酸緩沖液，30℃浸泡2.5h，過濾。濾液經(jīng)4000r/min離心15min，上清液為所需的粗纖維素酶液。稱取2-3g發(fā)酵產(chǎn)物，使用粗纖維測(cè)定儀檢測(cè)粗纖維含量。

1.2.3正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)微生物生長(zhǎng)的影響因素及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別以康氏木霉、黑曲霉及混菌為發(fā)酵菌種，選擇發(fā)酵時(shí)間、料水比、接種量和溫度為試驗(yàn)因子，進(jìn)行四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)。以酒糟發(fā)酵過程中產(chǎn)品纖維素酶酶活為考察指標(biāo)，進(jìn)行發(fā)酵菌種的選擇。

1.4測(cè)定方法

1.4.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取7支25m L比色管，分別加人1.0mg/m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2m L，補(bǔ)加蒸餾水至2.0m L，加入3.0m LDNS試劑，沸水浴顯色10mni，冷卻后定容至刻度，搖勻，54Onm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值A(chǔ)，以吸光值為橫坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2濾紙酶活性（FPA）測(cè)定

濾紙酶活（FPA）測(cè)定25m L具塞試管底部放人1張M狀的新華1號(hào)濾紙（1cm?6cm，50士lmg），加入1.5m Lp H4.6的0.2mol/L的醋酸緩沖液，加人0.5m L適當(dāng)稀釋的酶液，40℃保溫60min，加人3.0m LDNS試劑，沸水浴顯色10min，冷卻后定容，搖勻，54Onm波長(zhǎng)測(cè)吸光值，以相同條件下，失活的酶液作對(duì)照，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得生成的葡萄糖量。

1.4.3羧甲基纖維素酶活（CMCA）測(cè)定

25mL具塞試管中加人2.0mL10g/L的CMCNa溶液（以0.1lmol/L p H4.6的醋酸緩沖液配制），加人0.5m L適當(dāng)稀釋的酶液，40℃保溫30mni，其他同濾紙酶活測(cè)定。

酶活定義：在40℃條件下，1s內(nèi)纖維素酶水解濾紙產(chǎn)生1mol葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活性單位（kat）。

其中：m為酶分解底物釋放的葡萄糖量，μg；N為酶液稀釋倍數(shù)；V為反應(yīng)用酶量，g；t為反應(yīng)時(shí)間，min；λ為酶活性，nkat。

2　結(jié)果與討論

2.1單菌發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1黑曲霉單菌發(fā)酵效果分析

首先進(jìn)行黑曲霉單一菌發(fā)酵，以發(fā)酵時(shí)間（A）、含水量（B）、接種量（C）和溫度（D）為試驗(yàn)因子，進(jìn)行四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)。以酒糟發(fā)酵過程中培養(yǎng)基中纖維素酶酶活為考察指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

表1　黑曲霉發(fā)酵正交試驗(yàn)L9（34）影響因素及水平

表2　黑曲霉L9（34）正交試驗(yàn)纖維素酶活直觀分析

表3　黑曲霉L9（34）正交試驗(yàn)纖維素酶活方差分析表

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在只接種黑曲霉的情況下，影響啤酒糟發(fā)酵過程中纖維素酶活的4個(gè)因素的主次關(guān)系為時(shí)間、接種量、料水比、溫度。優(yōu)組合為A3B3C2D3，對(duì)該優(yōu)化組合進(jìn)行驗(yàn)證，即在時(shí)間為3天，料水比1：1.5，接種量20%，溫度34℃的條件下發(fā)酵，測(cè)量結(jié)果為纖維素酶活為706.427 nkat。

2.1.2康氏木霉單菌發(fā)酵效果分析

在康氏木霉單菌發(fā)酵中，以發(fā)酵時(shí)間（A）、含水量（B）、接種量（C）和溫度（D）為試驗(yàn)因子，進(jìn)行四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)。以酒糟發(fā)酵過程中產(chǎn)品粗纖維素酶酶活為考察指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與黑曲霉單一發(fā)酵試驗(yàn)相同見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表4、表5。

表4　木霉發(fā)酵正交試驗(yàn)L9（34）纖維素酶活直觀分析

表5　木霉L9（34）正交試驗(yàn)纖維素酶活方差分析表

通過表4、表5可知，在僅接種木霉的情況下，影響啤酒糟發(fā)酵過程中纖維素酶活的4個(gè)因素的主次關(guān)系為時(shí)間、接種量、料水比、溫度。因最優(yōu)組合為A3B3C3D3，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，在時(shí)間為3天，料水比1：1.5，接種量30%，溫度34℃的最佳條件下發(fā)酵，測(cè)量結(jié)果為纖維素酶活為459.230 nkat。略低于黑曲霉單菌發(fā)酵產(chǎn)酶效果。

2.2混菌發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)黑曲霉、木霉進(jìn)行混菌發(fā)酵中，以以發(fā)酵時(shí)間（A）、含水量（B）、菌種比（C）、接種量（D）和溫度（E）為試驗(yàn)因子，進(jìn)行五因素四水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)。以酒糟發(fā)酵過程中產(chǎn)品纖維素酶酶活為考察指標(biāo)。試驗(yàn)安排、試驗(yàn)結(jié)果及試驗(yàn)分析如表6、表7、表8所示。

表6　混菌正交試驗(yàn)L16（45）影響因素及水平

表7　混菌L16（45）正交試驗(yàn)纖維素酶活直觀分析

表8　混菌L16（45）正交試驗(yàn)纖維素酶活方差分析表

從表7、表8可看出，在進(jìn)行混菌試驗(yàn)時(shí)，影響啤酒糟發(fā)酵過程中纖維素酶活的5個(gè)因素的主次關(guān)系為溫度、料水比、時(shí)間、接種量、菌種比。最優(yōu)組合為A2B2C2D1E3，該組合單獨(dú)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，當(dāng)條件為料水比為1：0.5，混菌接種20%，其中黑曲霉比木霉接種量為6：4，在32℃下培養(yǎng)3天時(shí)，測(cè)量結(jié)果為纖維素酶活為812.380 nkat，所產(chǎn)纖維素酶活性最大。

3　結(jié)論

為優(yōu)選一次混菌發(fā)酵菌種，以康氏木霉、黑曲霉及混菌為發(fā)酵菌種，選擇發(fā)酵時(shí)間、料水比、接種量和溫度為試驗(yàn)因子，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。以酒糟發(fā)酵過程中產(chǎn)品纖維素酶酶活為考察指標(biāo)，比較其纖維素分解能力，結(jié)果表明：

黑曲霉在時(shí)間為3天，料水比1∶1.5，接種量20%，溫度34℃的條件下發(fā)酵，測(cè)量結(jié)果為纖維素酶活為706.427 nkat。

康氏木霉在時(shí)間為3天，料水比1∶1.5，接種量30%，溫度34℃的條件下發(fā)酵，測(cè)量結(jié)果為纖維素酶活為459.230 nkat。

混菌發(fā)酵中，料水比為1∶0.5，混菌接種20%，其中黑曲霉比木霉接種量為6∶4，在32℃下培養(yǎng)3天時(shí)，纖維素酶活為812.380 nkat。

表明混菌發(fā)酵效果比單菌種發(fā)酵效果更好，所產(chǎn)生的纖維素酶活更高。

［1］鄧啟華，傅力，王德.啤酒糟成分測(cè)定及飼料開發(fā)的研究——蛋白含量及纖維組分的分析［J］.啤酒科技，2008，15（12）：52-54.

［2］孫丹鳳，王友煒，王聰.發(fā)酵啤酒糟營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定及對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響［J］.飼料工業(yè)，2009，30（17）：26-28.

［3］王冰，方熱軍.酶解發(fā)酵啤酒糟在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.廣東飼料，2011，20（08）：41-42.

［4］蔡俊.啤酒糟發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2001，34（3）：30-31.

［5］郭素環(huán)，周碧君，文明，等.酒糟生物飼料對(duì)肉牛育肥及免疫功能的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，49（14）：126-129.

［6］Stojceska V，Ainsworth P，Plunkett A，et al.The recycling of brewer＇s processing by-product into ready-to-eat snacks using ectrusion technology［J］.Journal of Cereal Science，2008，47（3）：469-479.

［7］杜先林，李輝，王義強(qiáng)，等.里氏木霉Rut-30產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30 （9）：112-119.

［8］劉小杰，何國慶，陳啟和.康氏木霉ZJ5纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：工學(xué)版，2003，37（5）：127-132.

［9］王儀明，張宇舟，藺海明，等.綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力的研究［J］.草業(yè)科學(xué)，2009，26（5）：123-127.

［10］李燕紅，趙輔昆.纖維素酶的研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)，2005，17（5）：20-25.

［11］王洪媛，范丙全.三株高效秸稈纖維素降解真菌的篩選及其降解效果［J］.微生物學(xué)報(bào)，2010，50（7）：870-875.

［12］魏亞琴，李紅玉.纖維素酶高產(chǎn)菌選育研究進(jìn)展及未來趨勢(shì)［J］.蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，44（1）：107-115.

Ideal Growth Conditions for Cellulase Enzymatic Produced Using Brewer＇s Spent Grain Through Fermentation

HUANGHE Qing-tao1，YI Cheng2，WU Du-qing3，BIN Dong-mei2，RAO Li-qun1
（1.College of Life Science and Environment，Hengyang Normal University，Hengyang Hunan 421008，China；2.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128，China；3 Yanjing（Hengyang）Beer Company，Hengyang Hunan 421008，China）

To optimize growth conditions，we selected aspergillus niger and trichoderma koningii，and optimized the best fermentation conditions of a single strain and mixed strains based on carboxymethyl cellulose enzyme activity by orthogonal design tests.The results showed that aspergillus niger fermentation optimum conditions of the fermentation time was 3d at 34℃，the ratio of water to material was 1.5：1，and inoculum amount was 20%，respectively.Under the above-mentioned conditions，the carboxymethyl cellulase activity can reach 706.427 nkat.Trichoderma koningii fermentation optimum conditions of the fermentation time were 3d at 34℃，the ratio of water to material was 1.5：1，and inoculum amount was 30%，respectively.Under the above-mentioned conditions，the carboxymethyl cellulase activity can reach 459.230 nkat.The mixed fermentation optimum conditions of the fermentation time were 3d at 32℃，the ratio of water to material was 0.5：1，and inoculum amount was 20%，Aspergillus niger and Trichoderma koningii inoculum amount was 6：4，respectively.Under the above-mentioned conditions，the carboxymethyl cellulase activity can reach 812.380 nkat.It turned out that the effects of mixed fermentation is better than one strain fermentation and the cellulase activity by mixed fermentation is higher.

brewer＇s grains；mixed bacteria；fermentation；cellulase

Q552

A

1673-0313（2015）06-0127-04

2015-09-15

湖南省自然科學(xué)基金省市聯(lián)合基金（編號(hào)：14JJ5001）

賓冬梅（1970-），女，湖南衡陽人，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：農(nóng)副產(chǎn)品開發(fā)與利用。