徐鳴曙,陳春艷,李昌植,葛林寶,張淑靜,趙丹,李明哲,韓清,張英杰

(1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;2.上海市氣功研究所,上海 200030;3.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203)

自Globus首先證實多巴胺(dopamine,DA)在缺血性腦損傷中的作用以來,人們便對DA在缺血性腦損傷中的作用機制進行了廣泛而深入的研究。腦內(nèi)微透析發(fā)現(xiàn),腦缺血時可引起紋狀體、海馬等部位DA和興奮性氨基酸(exicted amine acid,EAA)的大量堆積[1]。在腦缺血再灌注過程中DA自身的神經(jīng)毒性、代謝產(chǎn)物的神經(jīng)毒性、增強EAA的毒性以及誘導(dǎo)凋亡等作用[2-4]在腦缺血再灌注損傷中具有重要作用。多巴胺轉(zhuǎn)運體(dopamine transport,DAT)在維持突觸間DA適當(dāng)濃度中發(fā)揮重要作用,而多巴胺D1受體(D1R)和D2R是其發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)之一。本實驗采用大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,觀察電針、D1R工具藥及針藥結(jié)合對腦缺血再灌注大鼠紋狀體內(nèi)D1R和DAT表達的影響,以期探討電針干預(yù)對缺血性腦損傷的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級健康雄性Sprague Dawley大鼠47只,體重(300±20)g,實驗大鼠均購自中科院上海實驗動物中心。動物飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級實驗室飼養(yǎng),溫度 20～25℃,濕度 40%～70%,噪聲＜60 dB,換氣次數(shù) 10～20次/h,工作照度12 h明12 h暗,實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 主要試劑

多巴胺D1受體激動劑(SKF38393,Sigma公司,批號065K4615);多巴胺D1受體拮抗劑(SCH23390,Sigma公司,批號015K4630);D1R多克隆抗體(兔抗鼠)(Santa Cruz公司,批號SC-14001);DAT多克隆抗體(兔抗鼠)(Santa Cruz公司,批號SC-14002);EnVision kit(DAKO公司,批號GK500705)。

1.3 主要儀器

環(huán)球牌針灸針(蘇州針灸用品廠),0.30 mm×13 mm;G6805-ⅠA型電針儀(上海華誼醫(yī)用儀器廠)。

1.4 模型制作

參照Longa EZ[5]的方法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型。

1.5 動物分組

按隨機分組原則將SD雄性大鼠分為空白組、模型組、電針組、激動劑組、電針＋激動劑組、拮抗劑組、電針＋拮抗劑組?？瞻捉M5只,其余各組均7只。

1.6 動物處理

空白組:正常對照組。

模型組:成功制備線栓法大鼠大腦中動脈缺血(MCAO)再灌注模型。

電針組:制備腦缺血再灌注模型,再灌即刻予電針治療,取雙側(cè)風(fēng)池穴,選連續(xù)波,頻率2 Hz,強度以大鼠耳廓輕度抖動為度(約 3 mA,示波器檢測),共2次,每次25 min,間隔10 min。

激動劑組:制備腦缺血再灌注模型,再灌即刻予1 mg/kg的劑量予腹腔注射SKF38393。

電針＋激動劑組:制備腦缺血再灌注模型,再灌即刻予電針治療＋腹腔注射SKF38393。

拮抗劑組:制備腦缺血再灌注模型,再灌即刻予1 mg/kg的劑量予腹腔注射SCH23390。

電針＋拮抗劑組:制備腦缺血再灌注模型,再灌即刻予電針治療＋腹腔注射SCH23390。

1.7 神經(jīng)功能缺損評分

各組處死前(再灌225 min)進行神經(jīng)功能評分[6]。

1.8 指標檢測

1.8.1 取材

實驗結(jié)束時用10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉動物,經(jīng)心臟灌注,先用 36℃的生理鹽水(大約250 mL),再用室溫的4%多聚甲醛400～500 mL,至大鼠四肢僵硬皮膚蒼白為度。斷頭取腦,腦組織置于 4%多聚甲醛后固定6～8 h,然后浸于20%蔗糖中至沉底,4℃保存7 d后剝離紋狀體(主要是尾狀核)備用。

1.8.2 免疫組化檢測

參照試劑盒說明書進行免疫組化實驗。

1.8.3 觀察方法

用已知陽性標本作陽性對照,陰性對照用PBS代替一抗,陽性產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色,圖像分析用MOTIC數(shù)碼醫(yī)學(xué)細胞圖像分析系統(tǒng)。選取5個染色明顯的視野(×400)計數(shù)檢測指標的陽性表達面積光密度,組間進行比較。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,所有結(jié)果以均數(shù)±標準差表示,各組用單因素方差分析,組間兩兩比較用N-S-K法進行檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較

由表1可見,電針組與模型組比較,神經(jīng)功能缺損評分均顯著降低(P＜0.05);激動劑組、電針＋激動劑組分別與電針組比較,神經(jīng)功能缺損評分均顯著升高(P＜0.05);激動劑組、電針＋激動劑組分別與電針＋拮抗劑組比較,神經(jīng)功能缺損評分均顯著升高(P＜0.05);其余各組間比較有差異,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評分、D1R積分光密度、DAT積分光密度比較 (x±s)

2.2 各組D1R積分光密度比較

由表1可見,拮抗劑組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),而其他各組與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。電針組、拮抗劑組、電針＋拮抗劑組與模型組比較,D1R積分光密度有所下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。激動劑組與電針＋激動劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),且這兩組D1R積分光密度與模型組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。電針組D1R積分光密度與電針＋拮抗劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),但這兩組與拮抗劑組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 各組DAT積分光密度比較

由表1可見,各組DAT表達與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);但除模型組外各組間比較有差異,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

腦血管疾病是危害人類生命與健康的主要疾病之一,其中80%以上系由腦部缺血造成。針刺治療中風(fēng)有效,但具體作用機制尚未闡明。多巴胺是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì),與缺血性腦損傷關(guān)系密切[7-8]。DR和DAT是分別位于突觸后膜和突觸前膜上的DA特異性受體和轉(zhuǎn)運體,二者共同作用保持了DA胞內(nèi)外相對平衡,及其功能發(fā)揮。此外,D1R通過AC/cAMP/PKA通路、MAPK通路等信號途徑,調(diào)控細胞內(nèi)Ca2﹢水平、K﹢通道和Na﹢/K﹢-ATP酶活性,參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外Na﹢、K﹢、Ca2﹢等離子平衡[9-10]。

本研究主要集中于D1R和DAT,研究顯示造模后大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯增高,并伴隨 D1R表達的顯著升高,與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。電針處理可明顯下調(diào) D1R的表達,同時減輕神經(jīng)功能缺損的評分。提示電針可能通過調(diào)節(jié)D1R的表達而間接調(diào)節(jié)腦缺血再灌注過程中細胞內(nèi)Ca2﹢水平、K﹢通道、Na﹢/K﹢-ATP酶的活性、突觸后膜KA/NMDA受體對Glu敏感性等,并最終使腦組織得到保護。

在電針基礎(chǔ)上加用激動劑可使電針效應(yīng)完全消除,顯示激動劑可阻斷電針的腦保護作用。單純使用激動劑,不予電針,其結(jié)果與模型組相似,之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該結(jié)果提示,該D1R激動劑無明顯腦保護作用;缺血 90 min所造成的損傷已接近相對最嚴重的程度,D1R激動劑很難進一步加重損傷;若缺血損傷較輕時,加用D1R激動劑,就可能表現(xiàn)出加重損傷的效應(yīng)。

綜合神經(jīng)功能缺損評分的結(jié)果進行分析,顯示電針組恢復(fù)作用明顯,D1R表達也明顯下調(diào);加用拮抗劑,未使神經(jīng)保護的效應(yīng)進一步增強;而單獨使用拮抗劑,對神經(jīng)功能缺損有明顯保護作用,但與電針組尚略有差距,然而其D1R下調(diào)至正常水平。該結(jié)果從側(cè)面反映,即使D1R恢復(fù)至正常水平,神經(jīng)功能缺損依然存在。電針+拮抗劑組雖然D1R明顯恢復(fù),但未至正常水平,然而其神經(jīng)功能恢復(fù)與電針組相當(dāng)。該結(jié)果提示,電針與D1R的效應(yīng)不重合,D1R不是電針效應(yīng)的唯一途徑;D1R在腦損傷修復(fù)中并非越少越好,應(yīng)維持一定量。

綜合行為學(xué)觀察及D1R激動劑、拮抗劑的結(jié)果,分析后可以得知,在缺血再灌注腦損傷及保護中,除D1R外尚有其他因素的參與,故D1R的作用雖較重要,但也較有限;電針發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用不能等同于D1R的作用,電針和D1R的效應(yīng)不能做簡單的疊加,調(diào)節(jié)D1R通路只是電針發(fā)揮其作用的途徑之一。

從本實驗DAT表達結(jié)果來看,雖然模型組與各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,但除模型組外各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明電針、工具藥等干預(yù)方法可能對腦缺血再灌注條件下DAT的表達無影響,即DAT的表達與D1R介導(dǎo)和電針調(diào)節(jié)關(guān)系甚微,但此假設(shè)尚待進一步驗證。

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