杜麗 秦丹卿 王繼成 郭浩 袁騰龍 王奕霞 張艷霞 梁駒卿 駱明勇 吳菁

5個家系δβ地中海貧血的家系分析及產(chǎn)前診斷

杜麗 秦丹卿 王繼成 郭浩 袁騰龍 王奕霞 張艷霞 梁駒卿 駱明勇 吳菁★

目的 對5個δβ地中海貧血家系進行分析及產(chǎn)前診斷。 方法 采集家系成員外周血進行血細胞分析，應用毛細管電泳技術對血紅蛋白進行分析，采用裂隙聚合酶鏈反應（Gap-PCR）以及PCR結合反向點雜交（PCR-RDB）方法對來自外周血及羊水、絨毛的 αβ珠蛋白進行基因突變鑒定。

結果 檢測到中國型Gγ+（Aγδβ）0地中海貧血攜帶者5例，中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧復合β地貧導致的重型地中海貧血1例，3個胎兒為中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧復合β地貧。 結論 對高風險家庭進行產(chǎn)前診斷避免重型地貧患兒的出生，對于優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。

δβ地中海貧血；基因診斷；產(chǎn)前診斷

［KEY WORDS］δβ-thalassemia；Gene diagnosis；Prenatal diagnosis

β地中海貧血（β地貧）主要由β珠蛋白基因突變引起，少部分是由于β珠蛋白基因缺失導致。δβ地貧主要是指累及δ珠蛋白基因和β珠蛋白基因在內的缺失，部分缺失類型包括Aγ、Gγ和ε珠蛋白基因的缺失。我國最常見的δβ地貧為中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧，此類缺失突變與β地貧點突變的雙重雜合子可導致中間型或重型β地中海貧血［1-2］。我們對5個中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧家系進行分析，并進行了產(chǎn)前診斷，報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象

2013年1月 ～2014年4月在我院醫(yī)學遺傳中心就診并進行產(chǎn)前診斷的5個家系。

1.1.1 家系1

孕婦就診時孕22+周，外院檢測地貧基因型βCD41-42/βN，丈夫外院常規(guī)αβ地貧基因檢測未見異常，自述2011年順產(chǎn)一女孩，1歲因重度貧血夭折，要求進行產(chǎn)前診斷。對其丈夫明確診斷后羊水穿刺進行地貧產(chǎn)前基因診斷。

1.1.2 家系2

孕婦就診時孕12+周，2010年順產(chǎn)一女孩，外院診斷為重型β地中海貧血，基因型為βCD17/βCD17（后我院診斷基因型為Gγ+（Aγδβ）0/ βCD17），孕婦本人外院常規(guī)αβ地貧基因檢測未見異常，丈夫外院檢測地貧基因型為βCD17/βN，要求進行產(chǎn)前診斷。對孕婦本人及重型地貧患兒明確診斷后絨毛穿刺進行地貧產(chǎn)前基因診斷。

1.1.3 家系3

孕婦就診時孕20+周，外院檢測地貧基因βCD41-42/βN，丈夫外院地貧篩查陽性，常規(guī)αβ地貧基因檢測未見異常，要求對丈夫進行地貧基因診斷。對其丈夫明確診斷后羊水穿刺進行地貧產(chǎn)前基因診斷。

1.1.4 家系4

孕婦就診時孕18+周，外院檢測地貧基因型βCD41-42/βN，丈夫外院地貧篩查陽性，常規(guī)αβ地貧基因檢測未見異常，要求對丈夫進行地貧基因診斷。對其丈夫明確診斷后羊水穿刺進行地貧產(chǎn)前基因診斷。

1.1.5 家系5

孕婦就診時孕20+周，2009年順產(chǎn)一女孩，數(shù)月因重度貧血夭折，孕婦本人外院檢測地貧基因型為βCD17/βN，丈夫外院地貧篩查陽性，常規(guī)αβ地貧基因檢測未見異常，要求對丈夫進行地貧基因診斷。對其丈夫明確診斷后羊水穿刺進行地貧產(chǎn)前基因診斷。

1.2 方法

1.2.1 血液學分析

用EDTA抗凝管采集5家系成員外周血2 mL，采用邁瑞B(yǎng)C-2000血液分析儀進行紅細胞參數(shù)分析。用ACD抗凝管采集該5家系成員外周血2 mL，采用Sebia capillarys 2全自動毛細管電泳儀進行血紅蛋白分析。

1.2.2 分子診斷

1.2.2.1 DNA提取 用ACD抗凝管采集5家系

成員外周血 2 mL進行αβ地貧基因診斷及 δβ地貧基因診斷。用無菌羊水管采集羊水 15 mL或者絨毛6支進行產(chǎn)前基因診斷。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒，按試劑盒說明書提取步驟進行DNA的提取。應用復合熒光標記短串聯(lián)重復序列（short tandem of repeat，STR）方法排除羊水及絨毛樣本母體組織的污染［3］，排除母體組織污染之后才進行產(chǎn)前基因診斷。

1.2.2.2 α地貧基因檢測 采用單管四重PCR基因診斷技術檢測--SEA、-α3.7、-α4.23種 α珠蛋白基因常見缺失型。采用裂隙聚合酶鏈反應結合反向點雜交（polymerase chain reaction-reverse dot blot，PCR-RDB）方法進行點突變的檢測，檢測范圍包括αCS、αQS、αWS3種點突變?；蛟\斷試劑由亞能生物技術有限公司（深圳）提供。

1.2.2.3 β地貧基因突變檢測 常規(guī) β地貧基因檢測采用PCR-RDB方法，基因診斷試劑盒由亞能生物技術有限公司（深圳）提供，可同時檢測中國人中常見的17種β-地貧基因突變：CD41-42 （-TCTT），IVS2-654（C→T），-28（A→G），CD71-72（+A），CD17（A→T），-29（A→G），CD43（G→T），-30（T→C），-32（C→A），βE（GAG→T），CD14-15（+G），CD31（-C），CD27-28（+C），IVS1-1 （G→T，G→A），IVS1-5（G→C），Cap+1（A→C），Initiation condon（ATG→AGG）。其中，IVS1-1 （G→T，G→A），IVS1-5（G→C），Cap+1（A→C），Initiation condon（ATG→AGG）無正常參照點。

1.2.2.4 中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧及東南亞型HPFH缺失檢測 采用裂隙聚合酶鏈反應（gap-PCR）方法檢測中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧缺失，引物設計及反應條件參考文獻［4］，Gγ+（Aγδβ）0缺失共用上游引物：CCAGCCTCATGGTAGCAGA ATC，Gγ+（Aγδβ）0缺失突變下游引物：TGGTATC TGCAGCAGTTGCC，Gγ+（Aγδβ）0缺失正常內對照下游引物：GTGATTGTTGAGTTG CAAGATCG，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR反應體系購自大連寶生物工程有限公司，PCR擴增反應條件為95℃預變性5 min；94℃ 45 s→ 60 ℃ 30 s→ 72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 延伸7 min。

2 結果

2.1 5家系成員的血液學指標分析及基因診斷結果

血細胞分析提示 5例中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧雜合子血紅蛋白均正常，平均紅細胞容積（meancorpuscular volume，MCV）降低。血紅蛋白分析提示5例中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧雜合子血紅蛋白A2 （HbA2）稍低或正常，血紅蛋白F（hemoglobin F，HbF）明顯升高；1例重型地貧患兒 （基因型Gγ+（Aγδβ）0/βCD17）血紅蛋白幾乎全部為HbF。5家系成員的血液學指標分析及基因診斷結果、產(chǎn)前診斷結果詳見表1，圖1-圖5。

表15 家系成員血細胞分析、血紅蛋白分析及基因診斷結果Table 1 Hematological and gene diagnosis data of the 5 families

圖1 家系1父母及胎兒中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧檢測電泳圖及雜交膜條圖

圖2 家系2父母、患兒及胎兒中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧檢測電泳圖及雜交膜條圖

圖3 家系3父母及胎兒中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧檢測電泳圖及雜交膜條圖

2.2 產(chǎn)前診斷結果及妊娠結局

在進行產(chǎn)前診斷的這5個家系中，3個胎兒為中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧復合β地貧。經(jīng)過充分的遺傳咨詢，胎兒父母均要求放棄胎兒，均于診斷后的3周內進行引產(chǎn)。

3 討論

δβ地貧以γ-珠蛋白基因持續(xù)表達，出生后HbF持續(xù)增高（5%～20%）為特征。δβ-地貧雜合子臨床表現(xiàn)為無貧血或輕度貧血，當合并β地貧時，可有中度或重度貧血，肝脾大，需要依賴規(guī)律輸血，類似于中間型或重型β地貧。而純合子的臨床表現(xiàn)也與中間型或重型β地貧相同。δβ地貧分子基礎為累及δ珠蛋白基因和β珠蛋白基因在內的β珠蛋白基因簇的大片段缺失，目前在世界不同種族至少發(fā)現(xiàn)了46種此類突變，中國人群最常見的缺失類型為中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧，中國型Gγ+（Aγδβ）0地中海貧血的基因缺失范圍包括 β珠蛋白基因簇Aγ、ψβ、δ和 β基因以及3′-HS-1區(qū)域，缺失長度為78.9 kb［1-2，5-7］。

圖4 家系4父母及胎兒中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧檢測電泳圖及雜交膜條圖

圖5 家系5父母及胎兒中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧檢測電泳圖及雜交膜條圖

中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧雜合子臨床表現(xiàn)為無貧血或者輕度貧血癥狀，HbA2正?；蛳陆?，HbF為10%～20%。本研究5個家系中的5個中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧雜合子臨床表現(xiàn)無貧血 （血紅蛋白 118～153 g/L），MCV降低 （66.2～71.3 fL），HbA2稍低或正常 （2.4%～2.8%），HbF明顯升高（14.2%～16.2%），與相關文獻報道相似［2，7-8］。當中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧復合 β地貧時臨床表現(xiàn)類似于中間型或者重型β地貧。在我們研究的5個家系中，2個家系的兩個孩子分別在數(shù)月和1歲因重度貧血夭折（高度可疑為中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧復合β地貧，未能證實），觀察到的1例中國型Gγ+（Aγδβ）0地貧復合 β地貧 （Gγ+（Aγδβ）0/ βCD17）患兒表現(xiàn)為重度貧血（血紅蛋白54 g/L），MCV降低 （63fL），血紅蛋白幾乎全部為 HbF （99.6%），無血紅蛋白A。

在廣東、廣西等地貧高發(fā)區(qū)，臨床醫(yī)生要重視δβ地貧。當進行地貧篩查時，如發(fā)現(xiàn)MCV降低，HbA2未見明顯異常而HbF明顯增高時，或者夫妻雙方基因診斷結果與重型地貧患兒基因診斷結果不符合時，應考慮存在δβ地貧的可能。當夫婦雙方分別為δβ地貧和β地貧雜合子時，應給予充分的遺傳咨詢和建議產(chǎn)前診斷，以免重型地貧患兒的出生。本研究通過5個δβ地貧家系分析和產(chǎn)前診斷病例的分享，為δβ地貧的遺傳咨詢、基因診斷和產(chǎn)前診斷提供一定的依據(jù)和指導。

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［2］ 覃麗波，陳萍，陳文強，等.廣西地區(qū)Gγ+（Aγδβ）0-珠蛋白生成障礙性貧血的研究［J］.實用兒科臨床雜志，2012，27（15）：1151-1153.

［3］ 尹愛華，張暢斌，梁駒卿，等.應用復合熒光標記STRPCR排除絨毛取材中母體細胞污染［J］.中山大學學報（醫(yī)學科學版），2007，28（S3）：203-205.

［4］ 徐湘民.地中海貧血預防控制操作指南第1版［M］.北京人民軍醫(yī)出版社，2011：111-115.

［5］Chen W，Zhang X，Shang X，et al.The molecular basis ofbeta-thalassemia intermedia in southern China：genotypic heterogeneity and phenotypic diversity［J］.BMC Med Genet，2010，11：31.

［6］ 李堅，李冬至.β-地中海貧血合并δβ-地中海貧血一個家系的產(chǎn)期診斷［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2008，16 （5）：66.

［7］ 李志琴，徐湘民，莫秋華，等.一個β-地中海貧血復合δβ地中海貧血家系的表型與基因型分析［J］.中華醫(yī)學遺傳學雜志，2001，18（4）：310-313.

Analysis and prenatal diagnosis of 5 families with δβ-thalassemia

DU Li，QIN Danqing，WANG Jicheng，GUO Hao，YUAN Tenglong，WANG Yixia，ZHANG Yanxia，LIANG Juqing，LUO Mingyong，WU Jing★
（Medical Genetics Center， Key Laboratory of Metabolic and Genetic Disease in Women and Children，Guangdong Women and Children Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，510010）

Objective To analysis 5 families with δβ-thalassemia and carry out the prenatal diagnosis.Methods Peripheral blood of the family members was collected.The whole blood cell analysis，capillary zone electrophoresis（CZE） were performed.αβ globin gene mutations were identified from peripheral blood，amniotic fluid and chorionic villus samples by Gap-PCR and polymerase chain reactionreverse dot blot（PCR-RDB）assay.Results 5 carriers of ChineseGγ+（Aγδβ）0-thalassemia and 1 case of severe anemia were detected.There were 3 cases of compound heterozygotes of ChineseGγ+（Aγδβ）0-thalassemia with β-thalassemia from 5 fetuses.Conclusions Clinicians should pay close attention to those who with reduced MCV and obvious increased Hb F.Compound heterozygote of δβ-thalassemia with β-thalassemia may lead to severe anemia.Prenatal diagnosis is very important for high-risk families.

廣東省科技計劃（2013B022000019）；廣東省醫(yī)學科學技術研究基金（A2014094）

廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心，廣東省婦幼代謝與遺傳病重點實驗室，廣東，廣州 510010

吳菁，E-mail：singhwu@126.com