楊超程昌明楊慧敏邱耕★

外周血循環(huán)腫瘤DNA檢測方法及應用

楊超1，2程昌明1楊慧敏1，2邱耕1，2★

腫瘤是一種威脅人類健康的重大疾病。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是基于分子水平上癌基因（oncogenes）的激活和抑癌基因（anti-oncogene）的失活所致?；蛲蛔兎治鰧τ谀[瘤診斷和預后至關重要。早期診斷被認為是提高癌癥病人治愈率，降低其死亡率最有效的途徑。外周血循環(huán)腫瘤核酸中可檢測到與腫瘤細胞一致的基因突變。這些基因突變的檢測可以為腫瘤的分期及藥物的治療療效和預后提供豐富的信息。因此，外周血循環(huán)腫瘤DNA突變檢測為腫瘤的早期診斷和治療提供了新的研究方向和領域。

腫瘤；循環(huán)腫瘤DNA；基因突變分析；外周血

［KEY WORDS］Tumor；Circulating tumor DNA；Gene mutation analysis；Peripheral blood

分子診斷是以分子生物學理論為基礎，利用分子生物學的技術和方法研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結構或表達調(diào)控的變化，為疾病的預防、預測、診斷、治療提供信息和決策依據(jù)。人類的許多遺傳性疾病、惡性腫瘤等重大疾病都是由于基因結構的變異所引起，因此，實現(xiàn)對基因熱點突變的早期、準確、簡便、快速的確認，對于人類相關疾病的發(fā)病機理及早期治療具有非常重要的意義。

1 腫瘤發(fā)生狀況與早期診斷

腫瘤是一類威脅人類健康的重大疾病。2008年全球腫瘤新發(fā)病例1 270萬例，死亡760萬例（美國NIH數(shù)據(jù)）［1-2］。預計到 2020年，全球腫瘤患者總數(shù)將超過1 500萬人，死亡人數(shù)超過艾滋病、瘧疾和結核病的總和，全球每年用于腫瘤診療的費用超過2 100億美元［3］。我國的腫瘤發(fā)病狀況同樣不容樂觀，據(jù)衛(wèi)生部最新統(tǒng)計資料顯示，我國大中城市腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，每年新增近260萬腫瘤患者。我國是一個人口大國，不僅腫瘤發(fā)病率高，而且死亡率也很高，惡性腫瘤患者年死亡率接近30%，5年以上生存率僅為31.77%［4］。目前臨床廣泛使用的手術切除、放療和化療等難以解決中晚期腫瘤治療的問題，在可預期的未來，通過對現(xiàn)有治療方案的改善遠不能大幅度降低腫瘤患者的死亡率。

實現(xiàn)腫瘤早期診斷是提高腫瘤治愈率，降低腫瘤患者死亡率的有效途徑。2005年世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）就指出：如果能夠早期發(fā)現(xiàn)，40%以上的癌癥是可以治愈的，包括乳腺癌、結腸癌、宮頸癌等最常見的癌癥［5］。由于在腫瘤發(fā)生的早期，患者沒有明顯的體征變化，難以通過一般生化和影像學檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤的蹤跡。而當患者有明顯體征時，腫瘤往往已經(jīng)發(fā)展到中晚期，錯失了治療的最佳時機。無論是手術治療還是放化療，大部分中晚期腫瘤病人都預后不良，生存時間極為有限。腫瘤血清蛋白標志物檢測是幫助發(fā)現(xiàn)早期腫瘤的一種重要方法，但是現(xiàn)有腫瘤血清蛋白標志物普遍存在特異性不強的問題。目前常用的腫瘤血清蛋白標志物如甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、糖鏈抗原-125（carbohydrate antigen 125，CA125）等，并非腫瘤細胞所特有，也會存在于某些良性腫瘤、胚胎組織、甚至正常組織中。以肝細胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC）為例，HCC是一種高度惡性腫瘤，早期多無明顯癥狀，確診時往往已屬中、晚期。目前HCC缺乏有效治療手段，中晚期HCC切除后復發(fā)率高，易轉移，其死亡率已居我國腫瘤死亡率的第二位。AFP是目前應用最廣泛的HCC腫瘤標志物，但仍有30%～40%的HCC患者AFP水平為正常，而活動性肝病、生殖腺胚胎瘤患者和妊娠婦女的AFP水平也會升高［6］。如何從健康人群中發(fā)現(xiàn)腫瘤的高危個體，并進行早期診斷，目前尚缺乏行之有效的方法。

2 外周血核酸檢測與腫瘤分子診斷

研究表明，腫瘤發(fā)生的根本原因在于分子水平上特定基因結構的改變。腫瘤的發(fā)生發(fā)展通常表現(xiàn)為多種基因結構改變（如突變、重組等）導致癌基因的激活或抑癌基因的失活，且不同發(fā)展階段其癌基因或抑癌基因的活性有所差別［7-9］。通常，從最初的基因結構改變到發(fā)生癌癥，大約需要十余年時間。所以，如果能在基因結構改變到轉化為癌癥的這個階段檢測到患者血液中腫瘤特異性核酸標志物，就可以對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進行有效的診斷和預測，獲得良好的治療效果［10-12］。

腫瘤的侵襲和轉移伴隨其發(fā)生發(fā)展的整個過程，它包括一系列內(nèi)在聯(lián)系的步驟，即粘附、降解和移動。腫瘤細胞可以通過分泌抑制黏附因子表達的物質降低細胞的粘附性，增加其運動能力。因此，在腫瘤發(fā)生的早期，腫瘤細胞就已具有侵襲和微轉移的特性［13］。研究發(fā)現(xiàn)，具備侵襲和微轉移特性的腫瘤細胞可以破壞宿主結締組織而進入脈管系統(tǒng)。除此之外，診療操作也可使腫瘤細胞人為擴散進入外周血循環(huán)系統(tǒng)。通?？梢园岩蜃园l(fā)或診療操作進入人體外周血的腫瘤細胞稱為循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）［14］。顯然，如果能在腫瘤早期患者的外周血中檢測到循環(huán)腫瘤細胞，了解腫瘤細胞的基因突變狀況，對于腫瘤的早期診斷和個體化治療都具有十分重要的意義［15-16］。在腫瘤發(fā)生的早期，進入外周血的腫瘤細胞數(shù)量很少，通常約1×108個白細胞和5×1010個紅細胞中僅有數(shù)個腫瘤細胞，常規(guī)的檢測手段如影像學及血清腫瘤標記物檢查等，無法直接發(fā)現(xiàn)這些通過外周血液循環(huán)進行轉移的細胞。因此，為了提高循環(huán)腫瘤細胞的檢出率，需在檢測前對循環(huán)腫瘤細胞進行富集。目前，循環(huán)腫瘤細胞最主要的富集方法是免疫磁性分離法（immunomagnetic separation，IMS），見圖1。該方法通過磁珠表面的特異性單抗與腫瘤細胞表面抗原發(fā)生免疫識別反應，從血液中分離出待檢測腫瘤細胞［17-18］。這些特異性單抗主要針對上皮細胞抗原，如上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、細胞角蛋白（cytokeratin，CK）等；或器官特異性標志物，如前列腺特定抗原（prostate-specific antigen，PSA）、人表皮生長因子受體 （human epidermal growthfactor receptor，HER）的抗體等［19-20］。由于目前尚無循環(huán)腫瘤細胞特異性抗原，針對循環(huán)腫瘤細胞所采用的抗體識別能力較差，往往會造成假陽性或假陰性檢測結果，這些檢測特異性和靈敏性問題限制了循環(huán)腫瘤細胞檢測技術在腫瘤分子診斷中的應用［21-22］。

圖1 循環(huán)腫瘤細胞檢測［14］

除循環(huán)腫瘤細胞外，實現(xiàn)腫瘤分子診斷的另一種方法是外周血循環(huán)核酸檢測。腫瘤患者外周血中的循環(huán)核酸除了來源于凋亡的正常細胞外，還有來源于腫瘤細胞的核酸物質。1977年Leon等［23］人首次發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清或血漿中的循環(huán)核酸濃度高于正常人約10～100倍，該結論為腫瘤分子診斷提供了新的思路和方法。從外周血循環(huán)核酸的濃度看，在早期腫瘤患者血清或血漿中就可檢測出較高濃度的循環(huán)核酸，而且這種循環(huán)核酸濃度的變化要遠早于影像學等檢測到的腫瘤組織變化［24-25］。關于腫瘤患者外周血循環(huán)核酸升高的原因有多種解釋，主要有以下3種觀點 （圖2）：（1）循環(huán)腫瘤細胞或微轉移灶的裂解；（2）腫瘤細胞的凋亡、壞死；（3）腫瘤細胞增生旺盛，自發(fā)性所釋放的核酸［26-27］。據(jù)文獻報道，按腫瘤患者外周血循環(huán)核酸濃度推算，每毫升血中至少應含1 000～10 000個腫瘤細胞，而實際每毫升血中僅能檢測到數(shù)個腫瘤細胞，顯然循環(huán)腫瘤細胞或微轉移灶的裂解并非外周血循環(huán)核酸濃度升高的主要原因［28］。腫瘤細胞自發(fā)性釋放核酸的觀點能較好地解釋腫瘤患者外周血出現(xiàn)高水平游離核酸的現(xiàn)象。腫瘤細胞相對正常細胞更容易脫落，脫落的腫瘤細胞進入血液后會被人體免疫細胞攻擊殺死，在酶的作用下成為核酸碎片，造成腫瘤患者血清中循環(huán)核酸濃度升高。但是現(xiàn)在越來越多證據(jù)也表明，除腫瘤細胞增生旺盛時自發(fā)釋放核酸外，腫瘤細胞凋亡也是外周血循環(huán)游離核酸的一個重要來源。

圖2 外周血中循環(huán)核酸的主要來源［27］

相比于從數(shù)以億計的血細胞中分離出數(shù)個腫瘤細胞的檢測技術，往往更容易從高濃度的外周血循環(huán)核酸中發(fā)現(xiàn)來自腫瘤細胞的核酸標志物，而且循環(huán)核酸中的突變基因與腫瘤的相關性高，具有更好的特異性，可作為腫瘤診斷的重要標志物。通過對外周血循環(huán)核酸中腫瘤核酸標志物進行定性和定量檢測，不僅可用于腫瘤篩查、早期診斷、輔助診斷、良惡性鑒別和臨床分期，對監(jiān)測療效、判斷預后、預測腫瘤的復發(fā)和轉移也具有重要價值［29-31］。由于外周血循環(huán)腫瘤核酸標志物檢測所需的樣本是外周血，易于取得，避免了活組織取樣對人體的傷害，作為一種微創(chuàng)性檢測技術，尤其適合健康人群和腫瘤高危人群的篩查，以及腫瘤患者術后的長期監(jiān)測。

3 外周血循環(huán)突變基因檢測

在腫瘤患者的外周血循環(huán)核酸中，大多數(shù)是來源于正常細胞凋亡所釋放的核酸 （簡稱為野生型），來源于腫瘤細胞的核酸（簡稱為突變型）在循環(huán)核酸總量中所占比例非常低。研究發(fā)現(xiàn)，在中晚期癌癥患者外周血循環(huán)核酸總量中所占的比例一般僅為8%～10%左右，在腫瘤早期甚至低至0.01%～1.7%［32-34］。此外，突變型與野生型相比僅一個或數(shù)個堿基的差別，所造成的基因理化特性改變甚微，無疑使檢測循環(huán)核酸中的低含量的突變型核酸極為困難，這也對該檢測技術的靈敏度提出了更高的要求。

目前，DNA測序法是核酸序列分析的 “金標準”，由于外周血循環(huán)核酸檢測中大量野生型的存在，直接測序僅能檢測到樣本中比例高于20%的突變型，難以達到檢測外周血循環(huán)核酸中低含量突變型核酸的要求［35-36］。另外，由于外周血循環(huán)核酸中存在大量的野生型，常規(guī)聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術對微少突變型進行擴增時容易產(chǎn)生偏向性擴增，即野生型由于數(shù)量占優(yōu)而被優(yōu)先擴增，導致樣本中突變型的相對比例進一步降低，不利于后續(xù)的突變型的檢測。除此之外，非特異擴增的干擾，實驗過程的繁瑣以及諸多不確定因素的影響導致此類方法對突變型的檢測靈敏度也只能達到1%～10%左右［37-40］，常見突變檢測技術見表1。因此，如何提高突變檢測的靈敏度，實現(xiàn)對循環(huán)核酸中腫瘤細胞特異性核酸標志物的檢測是生物醫(yī)學研究者亟待解決的難題。

表1 常見突變檢測技術的靈敏度Table 1 Sensitivity for detecting mutation of the routine gene analysis methods

近年來的研究表明，單純的生物學方法已很難進一步提高突變檢測的靈敏度，而將納米材料與分子生物學技術結合，借助納米材料的獨特性質提高對生物分子的檢測靈敏度已逐步成為生物醫(yī)學研究領域的一個熱點［49-50］。美國納斯達克上市的Luminex公司研發(fā)的液相懸浮芯片技術 （又稱微球依賴的懸浮點陣技術，Luminex xMAPTM），將熒光微球與探針特異性延伸反應結合，最后采用自行開發(fā)的液相芯片熒光檢測系統(tǒng)進行檢測，為高通量核酸分析提供了新的平臺，具有檢測時間短，微陣列應用靈活等優(yōu)點［51-52］，見圖 3。Cheng等［53-55］提出了基于磁性微球和微乳液PCR方法的BEAMing技術，通過乳液PCR擴增反應對微少突變基因進行擴增，避免了大量野生型基因對微少突變基因擴增的干擾，而且將擴增的突變基因富集在磁珠表面，再通過熒光分子信標（molecular beacon）探針雜交過程將突變信號轉化為磁性微球的熒光信號，最后通過流式細胞儀進行檢測，該方法對點突變基因的檢測靈敏度達到0.01%。但是上述兩種方法的檢測步驟煩瑣，對設備要求較高，而且檢測設備和試劑均需進口，檢測價格不菲，在我國難以得到廣泛使用。此外，上述兩種技術均采用熒光標記和分析方法，由于熒光染料比較容易淬滅，對突變檢測結果的穩(wěn)定性也有一定程度的影響。

圖3 基于納米材料的Barcode DNA蛋白檢測技術［50］

目前針對外周血腫瘤細胞循環(huán)核酸檢測技術的發(fā)展趨勢，作者所在研究團隊利用生物芯片上海國家工程研究中心的現(xiàn)有資源，通過查閱大量文獻專利，并向有關專家、學者咨詢，基于磁納米材料技術設計了兩條微少突變基因檢測技術路線，其技術具有特異性高、靈敏度高、成本低等特點。技術路線一，見圖4：采用乳液PCR（emulsion PCR）結合等位基因特異性擴增（allele-specific amplification）的懸浮液相芯片技術檢測核酸突變型，簡稱EARMS技術。該技術以乳液PCR作為靶基因擴增方式，避免了大量野生型對微量突變型擴增的干擾，通過等位基因特異性引物，實現(xiàn)突變型的特異性擴增和標記。同時，該技術結合磁性微球的特性，利用磁性分離方法將突變型分子數(shù)量轉化為磁珠的數(shù)量。最后通過熒光酶標儀或流式細胞儀對磁珠表面的突變型分子熒光信號進行檢測，以達到對突變型進行定量或定性分析的目的［55］。本技術將微少突變型的特異性擴增和標記簡化為一步反應，大大縮減了檢測步驟，降低了檢測成本。模擬樣本檢測結果顯示，該技術對突變基因的檢測靈敏度可達到0.1%～0.01%，基本滿足了外周血循環(huán)腫瘤核酸標志物檢測的要求。

圖4 乳液PCR結合等位基因特異性擴增的懸浮液相芯片技術檢測微少突變基因［55］

技術路線二，見圖5：采用磁珠分離技術結合連接酶檢測反應（ligase detection reaction，LDR）對核酸突變型進行特異性富集，最后采用高靈敏的電化學發(fā)光技術進行突變型檢測。該技術主要包括PCR預擴增、LDR連接和電化學發(fā)光基團標記、磁珠捕獲、電化學發(fā)光檢測4個步驟。首先對細胞或非細胞體系中提取的基因組DNA進行預擴增，然后針對發(fā)生點突變的堿基設計檢測探針和匹配探針，其中檢測探針5′端連接識別分子，匹配探針的3′端標記電化學發(fā)光信號分子。兩種探針以突變型為模板進行連接反應。然后通過表面帶有與探針識別分子匹配的捕獲分子的磁珠捕獲LDR連接產(chǎn)物。最后分離出磁珠，用電化學發(fā)光方法檢測磁珠表面的突變型信號［56］。該技術具有快速、高效、高通量、高靈敏度等優(yōu)點，可以檢測到樣品中含量低至0.01%的突變型型，具有極高的檢測靈敏度，并能達到多個突變同時檢測的目的，在腫瘤早期檢測領域有很好的應用前景。

圖5 連接酶檢測反應結合磁珠富集的電化學發(fā)光-突變基因檢測技術［56］

上述核酸突變型檢測技術主要針對外周血中腫瘤相關靶基因或突變進行檢測，可用于腫瘤的早期篩查、術后監(jiān)控以及用藥指導等，具有靈敏度高、特異性好、成本低的優(yōu)點。而且，由于所檢測樣本主要來源于外周血，來源豐富，易于獲取，避免了手術等手段對人體的傷害。本項目所涉及的相關技術作為一類微創(chuàng)性的檢測技術，尤其適合健康人群和腫瘤高危人群的篩查，以及腫瘤患者術后的長期監(jiān)控。目前，作者所在單位正以以上相關技術作為基礎開發(fā)相應的腫瘤檢測系列產(chǎn)品和服務，推進技術的產(chǎn)業(yè)化。

4 結語

目前，腫瘤的臨床診斷仍然依賴于病理或細胞學檢查，然而通過有創(chuàng)性組織活檢往往會給患者造成巨大的痛苦，因此探尋一種新的腫瘤診斷方法是當前迫切需要解決的問題。由于外周血循環(huán)核酸包含來自腫瘤細胞的核酸，具有和惡性腫瘤相關的分子生物學特征，可作為敏感高效的腫瘤分子標志物，它不僅能提供關于腫瘤發(fā)生和發(fā)展狀況的豐富信息，而且相對活組織取樣等創(chuàng)傷性取樣方式，循環(huán)核酸檢測具有取樣方便、微創(chuàng)的優(yōu)點，便于連續(xù)檢測和隨訪追蹤。所以基于外周血循環(huán)核酸開發(fā)一種靈敏度高、特異性強及結果判定簡單的腫瘤早期檢測方法將會成為腫瘤分子診斷技術研究的一個熱點和重要發(fā)展方向。隨著外周血循環(huán)核酸基礎實驗及臨床研究在深度及廣度上的日益加大，外周血循環(huán)核酸的檢測將為腫瘤篩查診斷、療效觀察及預后監(jiān)測展示出了廣闊的臨床應用前景。

隨著生物技術的發(fā)展，腫瘤的早期診斷、預后監(jiān)測、個體化治療以及復發(fā)監(jiān)控等越來越受益于腫瘤分子標志物的發(fā)現(xiàn)及其檢測方法的完善。盡管目前科學界對腫瘤發(fā)生的分子機制尚未完全明了，但基因結構的變化仍被認為是誘導腫瘤發(fā)生關鍵因素。通過對外周血循環(huán)核酸中來自腫瘤細胞的特異性基因結構改變進行檢測是腫瘤分子診斷的一個重要研究方向。高靈敏度微少突變型檢測技術的研發(fā)將為腫瘤分子診斷提供一種準確可靠的檢測工具，不僅有助于提高我國腫瘤的診治水平，填補國內(nèi)相關技術空白，而且也將推動分子診斷行業(yè)的發(fā)展，獲取巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。

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The detection methods and applications of circulating tumour DNA in peripheral blood

YANG Chao1，2，CHENG Changming1，YANG Huimin1，2，QIU Geng1，2★
（1.National Engineering Center for Biochip at Shanghai，Shanghai，China，201203；2.Shanghai Biomedical Lab Co.，Ltd，Shanghai，China，200436）

Tumor is a major threat to human health.Recent studies showed that oncogenesis were on account of the activation of oncogene and the inactivation of tumor suppressor gene at the molecular level.Gene mutation analysis is crucial in the diagnosis and prognosis of tumor.Early diagnosis has been proved to be the most effective way to improve the survival rates and decrease the mortality of cancer patients.Tests showed that gene mutations in the circulating tumor in peripheral blood were the same as what in tumor cells.The detection of these gene mutations may provide abundant information for the staging of tumor and the rapeutic effect and prognosis of drug.Hence， detecting of tumor-associated mutation in circulatory DNA in peripheral blood provides new direction for tumor early-stage diagnosis and therapy.

上海市科技成果轉化和產(chǎn)業(yè)化項目（13CT1900900）

1.生物芯片上海國家研究中心，上海 201203 2.上海伯豪醫(yī)學檢驗所，上海 200436

邱耕，E-mail：qiugeng@shbiochip.com