郭楊柳 吳楠 房海 陳翠珍 李艷云 王曉珊 盧會鵬 張東林

大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）是一種名貴的海洋經濟魚類，原產于英國。中國水產科學研究院黃海水產研究所的雷霽霖院士于1992年8月首次將其引入我國，并經過一系列關鍵養(yǎng)殖技術研究取得成功，很快在我國北方沿海地區(qū)形成了大規(guī)模的工廠集約化養(yǎng)殖生產［1］。近年來，隨著養(yǎng)殖量的迅速增大，尤其是集約化的高密度養(yǎng)殖生產，導致大菱鲆疾病相繼出現(xiàn)，特別是由某種病原微生物引起的感染?。↖nfectious diseases）時有發(fā)生，并常常會導致較大的經濟損失［2］。

作者在對養(yǎng)殖魚類感染病的病原研究中，從養(yǎng)殖大菱鲆患病死亡及瀕死魚中經常分離到病原細菌，其中尤以鰻弧菌（Vibrio anguillarum Bergeman 1909）的分離頻率較高，且分離菌株均具有較強的致病作用，能引起不同日齡大菱鲆發(fā)生敗血性感染病。本研究對從自然發(fā)生的大菱鲆鰻弧菌感染?。ㄋ溃~苗分離的鰻弧菌菌株，進行了比較系統(tǒng)的檢驗與分析，旨為對由鰻弧菌引起的大菱鲆弧菌病（Vibriosis）的有效預防與控制。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年5月，河北某水產養(yǎng)殖場的大菱鲆魚苗大量死亡。主要表現(xiàn)為體表彌漫性出血，有的病魚腹部臌脹、腹內積液（充盈淡紅色腹水），肝臟蒼白易碎。在5月13日的發(fā)病死亡高峰期，取發(fā)病后剛剛死亡大菱鲆魚苗進行病變特征檢驗后，分別以其肝臟組織及腹水為材料，接種于普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7％家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)24-48h；對分離菌做純培養(yǎng)并統(tǒng)一編號后，進行檢驗與分析。

1.2 方法

1.2.1 分離菌株的表觀分類學指征檢驗 對分離保存的純培養(yǎng)菌株，分別進行形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性等這些表觀分類學指征的系統(tǒng)檢驗。生理生化特性檢驗，采用法國BioméRieux細菌自動鑒定儀（ATB1525-expression），并對一些項目內容進行補充試驗［3］。

1.2.2 分離菌株的16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析 擇經表觀分類學指征檢驗后的代表菌株，進行16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析。方法是將供試菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，28℃（110r/min）振蕩培養(yǎng)16h作為供試菌液，采用北京賽百盛基因技術有限公司生產的樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒，參照相應的方法提取細菌DNA作為PCR模板。

以弧菌檢驗的通用引物，即對應于大腸埃希氏菌（Escherichia coli）16S rRNA基因第8-27個堿基位置的 5'-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3'為正向引物、對應于大腸埃希氏菌16S rRNA基因第1492-1510 個堿基位置的5'-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT -3'為反向引物（1492R），按常規(guī)方法對供試菌株進行16S rRNA基因序列的PCR擴增［4］；即在50μL反應體系中含有 2×PCRmix緩沖液 25μL、引物各 1μL、DNA 模板 4μL、無菌蒸餾水19μL，PCR反應條件為：95℃預變性3min；94℃變性 1min，55℃復性1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃溫育6min。所擴增的PCR產物經純化后，提交上海生工生物工程股份有限公司進行基因序列測定。

對所測定的基因序列，通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析，使用DNASTAR軟件與GenBank數據庫存中獲得的相似性較高的基因序列進行多序列匹配排列（Multiple Alignment），采用鄰接法（Neighbor joining method）構建分支系統(tǒng)樹。

1.2.3 免疫血清學檢定 以用已知大菱鲆病原鰻弧菌制備的全菌體抗原，經多次免疫家兔制備的相應抗血清，分別對供試菌株做玻片凝集反應，進行血清型的定性實驗，以呈現(xiàn)明顯凝集（++）判定為陽性。同時，分別以大菱鲆病原遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、正常健康家兔血清、無菌生理鹽水，作為陰性實驗對照［4］。

1.2.4 菌株分類位置確定 根據細菌形態(tài)特征、理化特性等表觀分類學指征的檢驗結果，主要參照第2版《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）及有關資料，并結合16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學、免疫血清學的測定結果，對供試菌株進行分類學的歸類判定［3，5］。

1.2.5 人工感染實驗 擇經分類鑒定后的代表菌株，以其純培養(yǎng)物分別移接普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，經28℃培養(yǎng)18h作為供試菌液。分別對體重200-250 g/尾的健康大菱鲆，進行腹腔注射接種的感染實驗（0.1mL/尾），以被感染發(fā)病、死亡，呈現(xiàn)出同自然?。ㄋ溃┐罅怫业陌l(fā)病和病變特征、并能從病變組織中重新分離回收到原感染菌，作為致病作用的判定指標；同時設立僅接種無菌普通營養(yǎng)肉湯的實驗對照，須在實驗觀察期內健康存活。供試大菱鲆在實驗前統(tǒng)一養(yǎng)殖于水溫19-21℃的實驗水族箱中，養(yǎng)殖觀察7 d且健康才可用于實驗。

2 結果

2.1 菌株與編號

取發(fā)病后剛剛死亡大菱鲆魚苗10尾進行細菌分離，從其肝臟組織及腹水中，均分離到了多量且純一的同種細菌。從每尾大菱鲆魚苗的分離菌，各取1個菌落移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)24h作為純培養(yǎng)菌，于4℃普通冰箱保藏供實驗用。菌株編號系按分離地與日期，依次為HC120513-1至 HC120513-10。

2.2 形態(tài)與培養(yǎng)特征

2.2.1 形態(tài)特征 取保藏的10株純培養(yǎng)菌，分別移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)24h后做涂片標本進行革蘭氏染色檢查，均為革蘭氏染色陰性、桿狀及短桿狀（多數菌體稍彎曲）、一端或兩端鈍圓（有的一端或兩端稍尖）、散在（個別成雙）、無芽孢、大小多在0.3-0.7 μm×1.0-2.2 μm。進行負染色的透射電子顯微鏡標本觀察發(fā)現(xiàn)，菌體彎曲、表面光滑，但不平整、有微泡（Micorovesicale）、端生單鞭毛（圖1）。常表現(xiàn)輕微下陷（菌落長入培養(yǎng)基中），刮下菌落后可見長入培養(yǎng)基中留下的菌落痕跡（圖4）。

圖2 鰻弧菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48h的菌落形態(tài)

圖1 鰻弧菌透射電子顯微鏡照片（×4 000）

2.2.2 生長情況與菌落特征 取保藏的10株純培養(yǎng)菌，分別移接于普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7％家兔血液）營養(yǎng)瓊脂、硫代硫酸鈉檸檬酸鈉膽酸鈉蔗糖瓊脂（Thiosulfate citrate bile salt sucrose agar，TCBS）培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)后檢查生長情況及菌落特征。結果在普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7％家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，與用此兩種培養(yǎng)基從病死大菱鲆魚苗所分離的一致，表現(xiàn)為在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h檢查菌落呈圓型光滑、邊緣整齊、較隆起、淺橘黃色、不透明、直徑多在0.8-1.0 mm（培養(yǎng)48h的多在1.5-1.8 mm），生長較豐盛（圖2）；在血液（含7％家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，生長情況與菌落特征基本同在普通營養(yǎng)瓊脂上的，培養(yǎng)24h的菌落直徑多在1.0-1.2 mm（培養(yǎng)48h的多在 1.5-2.0 mm），β-溶血（圖 3）；在 TCBS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h檢查不見明顯生長或僅形成直徑多在0.3 mm左右的小菌落（培養(yǎng)48h的可達1.2-1.5 mm），菌落圓形光滑、邊緣整齊、較隆起、黃色，常表現(xiàn)是僅在做劃線接種的起始部長出菌苔及少數菌落，菌落（苔）黏稠不易乳化，菌落周圍培養(yǎng)基

圖3 鰻弧菌在血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48h的菌落形態(tài)

2.2.3 適宜生長的溫度 取保藏的10株純培養(yǎng)菌，分別移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24-48h檢查，表現(xiàn)在37℃培養(yǎng)呈微弱生長，但比在28℃培養(yǎng)的表現(xiàn)生長緩慢。

2.3 理化特性

供試10株純培養(yǎng)菌，對所測項目的結果表現(xiàn)一致。均可還原硝酸鹽，對O/129敏感，剩余項目如表1所示。

2.4 16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育

擇經表觀分類學指征檢驗后的HC120513-1作為代表菌株，進行的16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析，結果得到了長度為1450bp的基因序列。將此菌株的16S rRNA序列在NCBI上進行同源性檢索發(fā)現(xiàn)，其與弧菌屬（Vibrio Pacini 1854）細菌的16S rRNA基因序列自然聚類；在檢索出的弧菌屬細菌序列中，此菌株與它們的同源性都在99％。選取20株弧菌屬細菌的16S rRNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育學分析，此菌株與編號為KC884632的鰻弧菌聚為一個分支（圖2）。

表1 供試菌株的理化特征

2.5 血清學凝集實驗

以10株純培養(yǎng)菌的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、28℃培養(yǎng)24h的培養(yǎng)物為全菌體抗原，進行的血清學凝集反應實驗，結果均與供試鰻弧菌全菌體抗血清呈現(xiàn)強陽性反應（++++），與正常健康家兔血清、無菌生理鹽水均為陰性。對照用的遲鈍愛德華氏菌，與供試鰻弧菌全菌體抗血清、正常健康家兔血清、無菌生理鹽水均為陰性（圖5）。

2.6 菌種判定

根據對10株供試菌表觀分類學指征的檢驗、16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育學分析、免疫血清學凝集反應檢定結果，綜合分析判定為弧菌屬的鰻弧菌。參考菌株：HC120513-1。

2.7 致病作用

將16尾供試大菱鲆，分為每組8尾的兩組隔離養(yǎng)殖于兩個實驗用水族箱中；其中的1組接種供試菌株HC120513-1的菌液為感染實驗組，另外1組接種普通營養(yǎng)肉湯為實驗對照組，分別養(yǎng)殖觀察。結果如表2所示，實驗組的8尾于接種感染后48h內均表現(xiàn)發(fā)病且死亡6尾（死亡率75.0％）；對照組8尾，養(yǎng)殖觀察7 d仍正常存活。

圖4 鰻弧菌在TCBS培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48h的菌落形態(tài)

圖5 實驗菌株與對照菌株的玻片凝集實驗

死亡6尾大菱鲆，均呈現(xiàn)出了同自然發(fā)病的出血、腹水等病變。取其肝臟組織及腹水為材料，接種于普通營養(yǎng)瓊脂、血液（含7％家兔血液）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置28℃培養(yǎng)48h，均分離到了大量純一的同種細菌；經做純培養(yǎng)后進行的主要理化特性檢驗，表明為原感染用的鰻弧菌。

3 討論

從發(fā)生大量死亡的養(yǎng)殖大菱鲆魚苗中分離的10株細菌，通過普通細菌學方法檢測為革蘭氏陰性菌，桿狀及短桿狀（多數菌體稍彎曲），端生單鞭毛，氧化酶反應呈陽性，能夠還原硝酸鹽，對弧菌抑制劑O/129敏感等，這些都符合弧菌屬的典型特征。這10株細菌還能夠利用檸檬酸鹽、丙二酸鹽和酒石酸鹽；分解阿拉伯糖、纖維二糖、半乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖和甘油產酸，不分解阿東醇、甜醇、赤蘚糖醇、肌醇、乳糖、蜜二糖、棉子糖、鼠李糖、水楊苷和木糖；過氧化氫酶、吲哚產生、V-P反應、明膠酶、DNA酶、β-半乳糖苷酶和精氨酸雙水解酶陽性；H2S產生、賴氨酸及鳥氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶、尿素酶、甲基紅試驗陰性；這是一些主要具有鑒別意義的項目，能夠在弧菌屬中有效區(qū)分鰻弧菌。由此，從生理生化鑒定看，實驗菌株接近于鰻弧菌。

表2 供試菌株對大菱鲆的回歸感染實驗結果

圖6 鰻弧菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

后續(xù)對10株細菌進行了DNA的提取，擴增了通用片段16S rRNA，并建立了系統(tǒng)進化樹，結果表明菌株與鰻弧菌KC884632聚為一支，相似度最高達到99.9％，而與霍亂弧菌X74696遺傳距離較遠一些，相似度只能達到93.9％，偏低。所以，從系統(tǒng)發(fā)育學和序列相似度上來看，實驗用菌株與鰻弧菌較近一些。

隨后分別又對回歸感染試驗分離出的細菌和原分離于病死成年大菱鲆病原鰻弧菌為抗原制備抗血清，能夠發(fā)生強凝集反應，這不僅對鰻弧菌的檢驗具有重要意義［6］，也初步顯示了在這些不同來源菌株間的血清型同源性；人工感染大菱鲆的實驗結果，顯示具有強致病作用。進一步說明盡管鰻弧菌雖屬于水環(huán)境微生物區(qū)系正常菌群的一種弧菌，但更是海水養(yǎng)殖魚類的一種常見的重要病原菌。據此，可考慮將此菌列為養(yǎng)殖用海水清潔度及弧菌病暴發(fā)的監(jiān)測菌。

已有的研究報告顯示，在水溫以及鹽度和有機物含量較高的養(yǎng)殖環(huán)境，鰻弧菌的數量急劇增加；養(yǎng)殖密度的增大、養(yǎng)殖水體中溶氧量的降低、養(yǎng)殖水溫的驟變等因素，可使魚類處于應激狀態(tài)并導致免疫機能下降，更容易引起鰻弧菌的感染［7］。顯然，在諸多養(yǎng)殖技術難以規(guī)范的實際情況下，應用鰻弧菌疫苗進行免疫接種的方法，可能會構成最為有效的途徑之一；但要做到這一點，對病原鰻弧菌的廣泛分離與檢驗是一個重要方面的內容，其中尤以血清學檢驗確定血清型別是最為需要的。但作為免疫原性來講，還需要明確在抗原表達、免疫保護效果方面的應用價值。對這些方面的內容，我們還在進一步的研究中；也期望能為魚類免疫預防的實踐應用，提供具有可行性的基礎資料。

4 結論

本次報告分離于大菱鲆魚苗的10株病原細菌，經過一系列形態(tài)特征和菌落特征觀察、生理生化鑒定、16S r RNA系統(tǒng)學發(fā)育分析鑒定是鰻弧菌，并對大菱鲆進行了回歸感染試驗，最終可得出這10株病原菌確實是導致大菱鲆致病的鰻弧菌。

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