羅夢(mèng)圓 紀(jì)家葵

誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞體外分化為生殖細(xì)胞對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐和人類生殖細(xì)胞發(fā)育機(jī)理的理論研究?jī)煞矫娑季哂兄匾饬x。近年來，有多篇研究報(bào)道誘道小鼠或人的胚胎干細(xì)胞分化可以觀察到類原始生殖細(xì)胞、類精子和類卵細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形成。早在2006年，Nayernia 等［1］就將小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)形成完全成熟并具有生理功能的精子，可使小鼠卵細(xì)胞受精，此受精卵植入小鼠卵巢可產(chǎn)下后代。但迄今仍未能從人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)出完全成熟并具有一定生理功能的卵細(xì)胞。要想獲得這樣的卵細(xì)胞，目前還有很多問題尚未解決，其中之一就是如何能有效檢測(cè)胚胎干細(xì)胞分化的階段。解決這一問題的有效手段之一是建立人胚胎干細(xì)胞向卵細(xì)胞分化的報(bào)告系統(tǒng)，將在卵細(xì)胞中特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子與熒光蛋白相連接，通過熒光蛋白的表達(dá)來指示胚胎干細(xì)胞體外分化的卵細(xì)胞階段。2009年，Kee等［2］在誘導(dǎo)人胚胎細(xì)胞分化的過程中就使用了VASA-eGFP檢測(cè)系統(tǒng)，將VASA基因啟動(dòng)子與eGFP蛋白的序列相連接，慢病毒感染人的胚胎干細(xì)胞，成功檢測(cè)并分離出分化的人胚胎干細(xì)胞中的原始生殖細(xì)胞群體。

ZP2（Zona pellucida 2）是組成卵細(xì)胞透明帶的重要蛋白之一。透明帶由哺乳動(dòng)物分泌的糖蛋白組成，包圍在卵母細(xì)胞周圍，對(duì)于哺乳動(dòng)物受精過程中的精卵識(shí)別、精卵結(jié)合以及避免多次受精現(xiàn)象有非常重要的作用［3］。ZP2和另一種組成透明帶的重要蛋白ZP3是已知的為數(shù)不多的僅在卵細(xì)胞中表達(dá)的蛋白，表達(dá)具有很高的組織特異性［4］。ZP2蛋白在表達(dá)后受到多種糖基化修飾［5］，與ZP3蛋白形成異源二聚體結(jié)構(gòu)［6］，最終形成透明帶。在功能上，ZP2與已發(fā)生頂體反應(yīng)的精子直接結(jié)合，是結(jié)合精子的第二受體［7］。Zp2敲除的小鼠卵母細(xì)胞透明帶變薄，無法正常排卵，即便取出這樣的小鼠的卵細(xì)胞在體外培養(yǎng)成熟并受精，得到的胚胎也無法正常發(fā)育［8］。人和小鼠的ZP2基因非常保守，在它們的5'末端有一段575bp的片段，其中有超過70％的堿基是一致的［9］。重組表達(dá)人ZP2蛋白的Zp2敲除小鼠，其透明帶的缺陷能得到部分修復(fù)［10］。ZP2的轉(zhuǎn)錄始于原始卵泡期之后，受到原始卵泡階段重要的轉(zhuǎn)錄因子Figlα的調(diào)控［11］。此后，隨著卵泡發(fā)育迅速上升，在卵細(xì)胞發(fā)育到半徑為50-60 μm時(shí)達(dá)到最高值，在卵子成熟及排卵開始時(shí)迅速降至最高值的5％以下［12］。ZP2的表達(dá)特異性使得其很適合作為指示卵母細(xì)胞發(fā)育階段的標(biāo)志基因。

本研究利用不同長(zhǎng)度的ZP2啟動(dòng)子片段與熒光蛋白eGFP相連接構(gòu)建出熒光報(bào)告質(zhì)粒。由于人類胚胎干細(xì)胞有不易被轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)，因此報(bào)告系統(tǒng)采用慢病毒感染的方式植入ZP2報(bào)告系統(tǒng)［13］。同時(shí)用人成纖維細(xì)胞WI38進(jìn)一步檢驗(yàn)該報(bào)告系統(tǒng)的組織特異性。由于人卵母細(xì)胞樣本珍貴、不易取得，本實(shí)驗(yàn)暫采用小鼠卵母細(xì)胞，通過體外培養(yǎng)和熒光觀察篩選出能特異指示卵母細(xì)胞的報(bào)告系統(tǒng)，旨為人類胚胎干細(xì)胞分化、卵母細(xì)胞的鑒定及卵母細(xì)胞的分離提供良好的工具和手段。

1 材料與方法

1.1 材料

293FT細(xì)胞培養(yǎng)液成分：DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）， 胎 牛 血 清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS），Glutamax，非必需氨基酸（Non-essential amino acid，NEAA），Pen/strip，Sodium Pyruvate，G418（Geneticin，遺傳霉素）。H9細(xì)胞培養(yǎng)液成分：Knockout DMEM（Knockout dulbecco’s modified eagle medium），血清替代物（Knockout Serum Replacer，KSR），Glutamax，NEAA，Pen/Strep，人基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Human Basic Fibroblast Growth Factor，hbFGF）。WI38細(xì)胞培養(yǎng)液成分：最低基礎(chǔ)培 養(yǎng) 液（Minimum essential medium，MEM），F(xiàn)BS，NEAA，Pen/Strep。以上試劑均購自Gibco公司。小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)和顯微操作用試劑：M2培養(yǎng)液（邁晨），M16培養(yǎng)液（邁晨），礦物油（Sigma）。構(gòu)建重組質(zhì)粒所用試劑盒pENTR 5'-TOPO TA cloning Kit（Invitrogen），pENTR Directional TOPO cloning Kit（Invitrogen），Gateway LR Clonase Ⅱ Plus Enzyme Mix Kit（Invitrogen）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所用試劑：opti-MEM（Gibco），Lipofectamin 2000（Invitrogen）。

1.2 方法

1.2.1 人ZP2啟動(dòng)子300bp和2500bp片段的克隆人ZP2啟動(dòng)子片段根據(jù)已知序列（Enrez Gene ID：7783）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1），模板為人WI38細(xì)胞的基因組DNA（基因組的提取按照DNeasy Blood＆Tissue Kit（QIAGEN）使用說明進(jìn)行）。利用Taq聚合酶（Invitrogen）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體積為50μL，其中 5μL 10×buffer-MgCl2，1μL 10mmol/L dNTP，1μL10μmol/L hZP2-300-F primer/ hZP2-2500-F primer，1μL 10μmol/L hZP2-R primer，4μL 57ng/mL WI38genome，0.2μL Taq Polymerase，38.3μL ddH2O。反應(yīng)程序 ：94℃ 5min ；94℃ 30s，60℃/65℃ 30s，72℃ 30s（300bp片段）/2min 30s（2500bp 片段），共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)Invitrogen公司測(cè)序確認(rèn)。

1.2.2 慢病毒包裝 所有病毒包裝用質(zhì)粒使用QIAGEN Plasmid Maxi Kit（QIAGEN）進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提。病毒包裝用293FT細(xì)胞鋪在175cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞密度約90％時(shí)可用于病毒包裝。病毒包裝液A：120μL Lipofectamine + 5mL Opti-MEM，包裝液 B ：10μg病毒包裝質(zhì)粒 Vsvg+ 15μg 病毒包裝質(zhì)粒?8.9+ 10μg ZP2報(bào)告載體 + 10mL Opti-MEM. 室溫靜置混合液A和B 5min，將A和B振蕩混合，室溫靜置20min。之后移除293FT細(xì)胞中原有培養(yǎng)液，將AB混合溶液均勻鋪在細(xì)胞表面，37℃恒溫箱中培養(yǎng)6h后棄掉培養(yǎng)瓶中的AB混合液，加入18mL 293FT細(xì)胞培養(yǎng)液（不含G418和PEN/STRIP）。將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入慢病毒培養(yǎng)室中37℃恒溫培養(yǎng)72h。之后收集培養(yǎng)瓶中的懸浮液入50mL離心管中，2000r/min離心5min，上清用Millex-HV 0.45μm的濾器過濾。產(chǎn)物在-80℃條件下保存。

表1 PCR反應(yīng)所用引物序列

1.2.3 未分化H9細(xì)胞的病毒感染 用于感染的H9細(xì)胞鋪在經(jīng)matrigel（BD）預(yù)處理的6孔板中至密度50％時(shí)用于病毒感染。移除細(xì)胞中原有的培養(yǎng)液，每孔加入1mL病毒原液。37℃恒溫培養(yǎng)6h后每孔補(bǔ)充2mL完全培養(yǎng)液，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。24h后棄去細(xì)胞中病毒溶液，每個(gè)孔加入2mL完全培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)過夜后棄去培養(yǎng)液，用含blasticidin的培養(yǎng)液篩選出已被成功感染的細(xì)胞，連續(xù)篩選3-5d，每天更換一次培養(yǎng)液。

1.2.4 細(xì)胞DAPI染色和熒光顯微觀察 細(xì)胞棄去原有培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）清洗兩次后，加入適量4％多聚甲醛（完全覆蓋細(xì)胞表面即可），室溫固定15min。去除多聚甲醛，PBS清洗后，加入含1μg/mL DAPI染料的PBS，避光染色20min。棄去染液，PBS清洗后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 小鼠卵母細(xì)胞的顯微注射和體外培養(yǎng) 小鼠卵母細(xì)胞從12周齡B6D2F1小鼠卵巢中獲得，置于在M2培養(yǎng)液中。利用Eppendof NK2顯微操作儀，將吸卵針連接到控制器上，調(diào)整到合適位置。向注射針中加入待注射質(zhì)粒，質(zhì)粒需用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提方法提取，并溶解在分子生物學(xué)級(jí)H2O中，再將注射針連接控制器。向培養(yǎng)皿蓋上滴加一滴M2培養(yǎng)液（5-10μL），并用礦物油封住液滴后，將之移至載物臺(tái)上。調(diào)整兩操作臂，使兩針均浸入M2液滴中，使之接近培養(yǎng)皿底部，但不能觸底。將準(zhǔn)備好的卵母細(xì)胞移入該液滴，吸卵針保持卵母細(xì)胞位置，注射針將一定量報(bào)告質(zhì)粒注射入卵母細(xì)胞細(xì)胞核中。注射完畢的小鼠卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至M16培養(yǎng)液中，37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，再熒光觀察。

2 結(jié)果

2.1 人ZP2啟動(dòng)子300bp和2 500bp片段報(bào)告載體的構(gòu)建

根據(jù)人ZP2基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)相應(yīng)上下游引物（表1），以WI38細(xì)胞系基因組為模板，PCR反應(yīng)后將產(chǎn)物通過DNA電泳檢測(cè)，在預(yù)期片段大小位置有特異條帶（圖1）。回收該條帶并通過酶切連接到pENTR-5'-TOPO載體，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序確定序列和插入方向無誤。將帶有ZP2基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pENTR-5'-ZP2 promoter與帶有報(bào)告基因eGPF的質(zhì)粒pENTR-D-eGFP和2k7bsd質(zhì)粒混合，其上帶有的同源重組的位點(diǎn)發(fā)生重組得到ZP2-300-eGFP和ZP2-2500-eGFP重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序檢驗(yàn)插入位點(diǎn)和序列無誤。

圖1 人ZP2啟動(dòng)子300bp（A）和2500bp（B）片段PCR結(jié)果

2.2 帶有人ZP2啟動(dòng)子報(bào)告載體的慢病毒包裝和滴度測(cè)定

重組質(zhì)粒經(jīng)過去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提后用于病毒的包裝，用于包裝病毒的293FT細(xì)胞在轉(zhuǎn)染帶有人ZP2啟動(dòng)子報(bào)告載體的重組質(zhì)粒和包裝病毒的輔助質(zhì)粒72h后可以觀察到預(yù)期的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，此時(shí)收集到的細(xì)胞上清液中含有大量帶人ZP2報(bào)告載體的慢病毒（圖2）。

病毒滴度用單位體積的病毒懸液所能感染的細(xì)胞數(shù)目表示。將獲取的病毒懸液稀釋到不同濃度后感染W(wǎng)I38細(xì)胞，用含2μg/mL blasticidin的細(xì)胞培養(yǎng)液篩選4d，計(jì)算篩選后的剩余細(xì)胞數(shù)，計(jì)算得出病毒滴度（表2）。滴度在104及以上的病毒可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 帶有人ZP2啟動(dòng)子報(bào)告載體的慢病毒包裝結(jié)果

表2 慢病毒滴度測(cè)定結(jié)果

2.3 帶有人ZP2啟動(dòng)子300bp和2500bp片段報(bào)告載體在非卵細(xì)胞中無報(bào)告熒光表達(dá)

將帶有人ZP2啟動(dòng)子300bp和2500bp片段報(bào)告載體的慢病毒感染W(wǎng)I38（人成纖維細(xì)胞）和未分化H9（人胚胎干細(xì)胞系）細(xì)胞，陽性對(duì)照使用EF1α-eGFP病毒感染293FT細(xì)胞，一定濃度的blasticidin篩選4d后進(jìn)行熒光顯微觀察，結(jié)果（圖3）顯示兩種報(bào)告載體慢病毒在感染W(wǎng)I38和未經(jīng)分化的H9細(xì)胞后都無綠色熒光蛋白表達(dá)，而陽性對(duì)照細(xì)胞中可以觀察到明顯的綠色熒光。

2.4 帶有人ZP2啟動(dòng)子2500bp片段的報(bào)告載體在小鼠卵細(xì)胞中檢測(cè)到報(bào)告熒光

圖3 ZP2-300-eGFP和ZP2-2500-eGFP病毒分別感染W(wǎng)I38細(xì)胞和未分化的H9細(xì)胞后熒光觀察結(jié)果

從12周大小的B2D6F1雌性小鼠的卵巢中取得小鼠GV（Germinal vesicle）期卵母細(xì)胞，放入M2培養(yǎng)液培養(yǎng)，將帶有人ZP2啟動(dòng)子片段的報(bào)告載體顯微注射入GV期卵母細(xì)胞的細(xì)胞核中，注射后卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入M16培養(yǎng)液，37℃恒溫培養(yǎng)，24h后觀察細(xì)胞熒光。對(duì)照組細(xì)胞從小鼠卵巢中取出后未進(jìn)行注射處理即放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，注射ZP2-2500-eGFP質(zhì)粒的小鼠卵母細(xì)胞可觀察到綠色熒光，而注射ZP2-300-eGFP質(zhì)粒和對(duì)照組細(xì)胞無綠色熒光。將有綠色熒光的卵母細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h后再次進(jìn)行觀察，仍能觀察到微弱綠色熒光。的難點(diǎn)之一。2003年，Hubner等［14］首次由小鼠胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化得到卵細(xì)胞。此后Gejisen等［15］將小鼠胚胎干細(xì)胞分化為胚體，利用SSEA1作為篩選標(biāo)記富集其中的原始生殖細(xì)胞，視黃酸體外誘導(dǎo)分化出類似精子的細(xì)胞，將其顯微注射入小鼠卵細(xì)胞后能發(fā)育到囊胚時(shí)期。2006年，Nayernia等［1］利用Stra8和Prm1報(bào)告系統(tǒng)，將小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化類似精子的細(xì)胞，用其受精后的卵細(xì)胞再植入小鼠體內(nèi)并成功獲得了后代，但這些后代在體型大小上與正常小鼠不同，且都在未成年之前死亡。2011年，Hayashi等［16］用 SSEA1和 Integrinβ3作為篩選標(biāo)記，從誘導(dǎo)分化的小鼠胚胎干細(xì)胞篩選出原始生殖細(xì)胞，移植回小鼠睪丸后發(fā)育為成熟精子，用這種方法獲得的精子能使小鼠卵細(xì)胞受精并發(fā)育為成熟后代。2012年，該作者又用類似的方法獲得了小鼠的成熟卵細(xì)胞，這種卵細(xì)胞能被正常小鼠精子受精并發(fā)育為成熟后代［17］。另一方面，在人類胚胎干細(xì)胞的研究中，早期多采用簡(jiǎn)單流式分選或標(biāo)記蛋白流式分選的方式來分離分化得到的原始生殖細(xì)胞，但一直未能獲得單倍體［18，19］。2009年，Kee等［2］采用VASA-eGFP報(bào)告系統(tǒng)，從BMPs誘導(dǎo)分化的人類胚胎干細(xì)胞中富集原生殖細(xì)胞，并通過高表達(dá)內(nèi)源因子DAZLBOULEDAZ的方式最終獲得單倍體精細(xì)胞。但至今尚未有成功將人胚胎干細(xì)胞體外分化有功能的成熟卵細(xì)胞的研究報(bào)道。

使用體外分化方式獲得人類成熟卵細(xì)胞面臨眾多問題，如早期分化過程中生殖細(xì)胞命運(yùn)的確定，減數(shù)分裂的起始和完成，卵泡結(jié)構(gòu)的成熟等。卵細(xì)胞發(fā)育過程中，初級(jí)卵泡階段會(huì)發(fā)生卵細(xì)胞第一次減數(shù)分裂停滯的恢復(fù)，此時(shí)卵細(xì)胞與顆粒細(xì)胞之間的相互作用較之前會(huì)顯著增強(qiáng)，這些變化對(duì)于卵細(xì)胞后期的發(fā)育成熟極為重要［20］。因此，建立報(bào)告系統(tǒng)，有效地指示出分化到初級(jí)卵泡及其之后時(shí)期的細(xì)胞對(duì)于最終獲得成熟卵細(xì)胞的研究很有意義。

本研究采用不同片段長(zhǎng)度的人ZP2啟動(dòng)子與綠色熒光蛋白eGFP構(gòu)建ZP2-300-eGFP和ZP2-2500-eGFP兩個(gè)報(bào)告系統(tǒng)，一般認(rèn)為基因的啟動(dòng)子越長(zhǎng)越利于保持其表達(dá)的時(shí)空特異性，片段過短會(huì)丟失某些關(guān)鍵調(diào)控元件，但較長(zhǎng)的片段整合入基因組的效率較低，同樣對(duì)報(bào)告系統(tǒng)的指示作用造成影響。從

圖4 經(jīng)顯微注射人ZP2報(bào)告載體的小鼠卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)和熒光觀察結(jié)果

3 討論

體外分化培養(yǎng)干細(xì)胞得到成熟生殖細(xì)胞具有重要的科學(xué)價(jià)值和臨床意義，但成熟生殖細(xì)胞的形成需要進(jìn)行減數(shù)分裂，其外觀和功能都發(fā)生了重大變化。因此，此類研究多年來一直是干細(xì)胞研究領(lǐng)域WI38細(xì)胞核未分化的胚胎干細(xì)胞H9的實(shí)驗(yàn)看，這兩種不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子都不會(huì)啟動(dòng)熒光報(bào)告基因在這些細(xì)胞中的表達(dá)。而顯微注射和熒光觀察的結(jié)果表明，ZP2-2500-eGFP報(bào)告系統(tǒng)可特異啟動(dòng)熒光報(bào)告基因在小鼠卵母細(xì)胞中的表達(dá)，可作為一種有效的工具應(yīng)用于胚胎干細(xì)胞向卵母細(xì)胞分化的研究中。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建ZP2-300-eGFP和ZP2-2500-eGFP兩個(gè)報(bào)告系統(tǒng)，通過在WI38細(xì)胞、未分化的H9細(xì)胞核小鼠卵母細(xì)胞中的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ZP2-2500-eGFP報(bào)告系統(tǒng)可以特異啟動(dòng)熒光報(bào)告基因在卵母細(xì)胞中的表達(dá)，而在其他細(xì)胞系中無報(bào)告熒光表達(dá)。

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