鄔志杰 吳更 唐鴻志 許平

尼古丁是一類廣泛存在于土豆、番茄和煙草等茄科植物中的天然生物堿［1］，尼古丁對哺乳動物能產(chǎn)生多種致病、致變、致癌效應(yīng)，且易溶于水，會污染土壤及水環(huán)境［2-4］。利用微生物來代謝尼古丁，是治理尼古丁污染的一種有效方法。

惡臭假單胞菌S16是一株尼古丁高效降解菌［5］，其利用吡咯途徑代謝尼古?。?］：尼古丁經(jīng)由N-甲基麥斯明、假氧化尼古丁、3-琥珀酰吡啶、6-羥基-3-琥珀酰吡啶（6-Hydroxy-3-succinoyl-pyridine，HSP）、2，5-二羥基吡啶（2，5-Dihydroxy-pyridine，DHP）、N-甲酰馬來酰胺酸、馬來酰胺酸、馬來酸及富馬酸，最終進入三羧酸循環(huán)［7，8］。

2011年，單加氧酶HspB及其編碼基因hspB被發(fā)現(xiàn)，其負(fù)責(zé)催化HSP轉(zhuǎn)化成DHP［9］。HspB以FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸、氧化態(tài)）為輔基，以NADH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原態(tài)）為輔酶，其催化底物發(fā)生羥化機制也已經(jīng)明確［10］。HspB在整個尼古丁代謝途徑中十分關(guān)鍵，將hspB基因缺失后，P. putida S16無法進行尼古丁代謝。因此，獲得HspB的結(jié)構(gòu)對于研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系十分有利。

通過基因工程構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達外源蛋白，獲得高純度的蛋白得到單晶，并用于X射線衍射，這是晶體衍射學(xué)常用的方法［11］。而前期研究也表明，可以通過大腸桿菌表達純化得到可溶性的帶有His標(biāo)簽的HspB蛋白。然而其晶體的培養(yǎng)卻十分困難［12］。雖然His標(biāo)簽對于蛋白結(jié)構(gòu)影響較小［13］，但也有文獻報道切除His標(biāo)簽可能會有利于晶體的培養(yǎng)，值得嘗試［14，15］，同時亦有許多蛋白結(jié)構(gòu)是通過切除His標(biāo)簽的蛋白獲得的［16-18］。

本研究在前期構(gòu)建的表達質(zhì)粒的基礎(chǔ)上［12］，通過突變PCR定點引入TEV蛋白酶酶切序列，從而實現(xiàn)了其重組蛋白產(chǎn)物能夠被TEV蛋白酶切割，達到去除His標(biāo)簽的目的，并利用該蛋白進行結(jié)晶研究。旨為后續(xù)獲得該蛋白結(jié)構(gòu)，闡釋其功能和結(jié)構(gòu)間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌種 表達質(zhì)粒pET28a-hspB（抽提自大腸桿菌DH5α），大腸桿菌DH5α 和大腸桿菌BL21（DE3）均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 FastPfu聚合酶購自全式金公司，Dpn I購自NEB公司，TEV蛋白酶（帶有N端6×His標(biāo)簽）為本實驗自制，酶質(zhì)粒小抽試劑盒購自Qiagen公司，實驗所用結(jié)晶試劑盒購自Hampton Research、EMBio、Jena Bioscience、Molecular Dimension等。其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 PCR儀（EDC 810）購自東勝公司，細胞破碎儀購自廣州聚能，Ni2+-NTA填充柱料購自Qiagen公司，水平與垂直電泳儀和凝膠成像儀均購自上海天能，?KTA prime Plus 購自GE，紫外分光光度計（UV-1800）購自上海美譜達。

1.2 方法

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-hspB-TEV-His構(gòu)建示意圖

1.2.1 引物設(shè)計、突變PCR及產(chǎn)物鑒定 為實現(xiàn)在重組HspB蛋白C端和6×His標(biāo)簽之間加入TEV蛋白酶酶切識別序列（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly）。本研究以表達質(zhì)粒pET28a-hspB為模板，并由此設(shè)計正反向突變引物。P1：5'-GAAAACCTGTATTTTCAGGGCCACCACCACCACCACCAC-3’；P2：5'-GCCCTGAAAATACAGGTTTTCCTCGAGAAAGGTTTCCAT-3'。引物的5'端是TEV蛋白酶酶切識別序列對應(yīng)的核苷酸堿基序列（下劃線部分），3'端則是模板序列（P1的3'端是6×His標(biāo)簽的核苷酸堿基序列；P2的3'端是hspB基因3'端序列（GenBank登錄號GQ857548.1）。由生工生物工程（上海）有限公司合成引物。突變PCR反應(yīng)體系：FastPfu 聚合酶0.5μL，5×FastPfu Buffer 5μL，5×stimulant 5μL，2.5mmo/L dNTP 1.5μL，模板質(zhì)粒 0.5μL，上下游引物 0.5μL，以 ddH2O補至25μL。反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 3min，25 個循環(huán) ；72℃10min。產(chǎn)物鑒定：1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET28a-hspB-TEV-His的構(gòu)建 向20μL PCR 產(chǎn)物中加入 1μL Dpn I進行消化，37℃，2h。將處理后的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆。提取質(zhì)粒送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。經(jīng)Blast比對，測序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pET28a-hspB-TEV-His。

1.2.3 HspB 蛋白的誘導(dǎo)表達 將pET28a-HspBTEV-His轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，于卡那霉素抗性平板上篩選陽性菌落。取陽性單菌落接種于50mL液體LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為50mg/mL的卡那霉素，37℃，220r/min培養(yǎng)過夜，作為種子液。以1 100的接種量接種到1 L液體LB培養(yǎng)基中，加入終濃度為50mg/mL的卡那霉素，37℃，220r/min培養(yǎng)至OD600為0.8，加入終濃度為0.2mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），16℃，180r/min誘導(dǎo)過夜。4℃，4 200r/min離心收集菌體。以1 L菌對應(yīng)20mL鎳柱平衡液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑）的比例重懸，并加入終濃度為100mg/L的抑肽酶、亮抑酶肽及250mg/L的苯甲基磺酰氟，混勻。

1.2.4 鎳柱親和層析 菌液于4℃進行細胞破碎（1300 bar，3次）后，4℃，14000r/min離心，去上清過鎳柱兩遍。鎳柱漂洗液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑）漂洗柱子兩遍。鎳柱洗脫液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，60mmol/L、200mmol/L咪 唑）5mL洗脫目的蛋白。SDS-PAGE分析。

1.2.5 TEV蛋白酶酶切 按酶與蛋白1 25的質(zhì)量比加入TEV蛋白酶進行酶切。本研究中采用了兩種酶切方法。柱上酶切法：將蛋白上清掛柱后漂洗兩次，封閉柱子，然后加入5mL鎳柱漂洗液，按比例加入TEV蛋白酶，混勻柱料，4℃過夜。收集漂洗液。透析酶切法：在洗脫液中按比例加入TEV蛋白酶，置于透析袋中，于1 L鎳柱漂洗液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，20mmol/L 咪唑）中 4℃漩渦過夜。

1.2.6 鎳柱除雜 在柱酶切法中直接收集酶切后漂洗液即可；透析酶切法則需要將透析液流穿鎳柱，收集流出液及漂洗液。兩種方法都需要用500mmol/L咪唑洗脫液洗脫柱上沒有酶切完全的蛋白和TEV酶，并進行SDS-PAGE檢測。

1.2.7 凝膠過濾層析 預(yù)先用平衡緩沖液（25mmol/L Tris pH8.0，300mmol/L NaCl，2mmol/L DTT，1mmol/L EDTA）平衡 Superdex200 HiLoad 16/600 凝膠層析柱（流速1.0mL/min，壓強上限0.4 MPa）至電導(dǎo)曲線平直。將收集的流出液及漂洗液注入5mL上樣環(huán)中。用一個柱體積（約130mL）的平衡緩沖液洗脫并收集洗脫液。結(jié)合紫外吸收峰和SDSPAGE分析純化效果。4℃，4 500r/min離心濃縮蛋白溶液，Bradford法測定蛋白濃度至12mg/mL，直接進行點晶或使用液氮速凍，并于-80℃保存。

1.2.8 SDS-PAGE分析 采用12％分離膠和5％濃縮膠制膠，電泳后使用考馬斯亮藍R250染色。

1.2.9 點晶 蛋白冰上解凍后，4℃，14000r/min離心5min后點晶。本實驗采用懸滴擴散法進行結(jié)晶。使用48孔（24孔）結(jié)晶板，下槽孔中的結(jié)晶試劑為 80μL（160μL）。在硅化玻片上依次滴加 1μL 蛋白溶液和1μL結(jié)晶試劑，再將蓋玻片反扣覆蓋在池孔上并用凡士林密封空隙。恒溫靜置培養(yǎng)。定期在顯微鏡下觀察晶體生長情況。

1.2.10 結(jié)晶條件優(yōu)化 以Index 2試劑盒的第83個條件為基礎(chǔ)，對結(jié)晶條件做進一步優(yōu)化。優(yōu)化蛋白濃度：嘗試13.5、12、9.5和7.5mg/mL濃度蛋白進行點晶。設(shè)計正交實驗對pH、沉淀劑和鹽離子濃度進行優(yōu)化：沉淀劑的濃度設(shè)置了以1％為單位，嘗試了12個梯度；鹽離子濃度以0.1mol/L為單位，嘗試了12 個梯度；pH以0.1為梯度嘗試了10個梯度；同時選擇了不同的沉淀劑（PEG200-10000）、鹽（各類鎂鹽及鹽酸鹽）和pH緩沖液成分（Mes、Bis-Tris和HEPES），確定最優(yōu)生長條件。添加劑篩選：控制原結(jié)晶條件不變，在液滴中加入0.2μL添加劑（96種添加劑均來自Additive Screen試劑盒）后靜置培養(yǎng)。優(yōu)化培養(yǎng)溫度：嘗試4、8、14、18和20℃下培養(yǎng)晶體。最后也嘗試了微接種法，以獲得單晶。

2 結(jié)果

2.1 pET28a-hspB-TEV-His重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

突變PCR反應(yīng)后，擴增產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在4-8 kb間可見一條與pET28a-hspB-TEVHis質(zhì)粒理論大?。?.4 kb）相符的條帶（圖3）。該PCR產(chǎn)物中包含環(huán)裝缺刻質(zhì)粒（目的產(chǎn)物）和痕量模板質(zhì)粒，經(jīng)Dpn I消化后轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單菌落送測序，經(jīng)比對，序列完全正確。

圖3 pET28a-hspB-TEV-His重組質(zhì)粒構(gòu)建

2.2 HspB-TEV-His蛋白的鎳柱親和層析

菌體破碎后，離心收集上清，通過鎳柱親和層析純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測，在45kD處有目的蛋白條帶（圖4），與預(yù)期（44.6kD）一致。上清、洗脫液中均有目的蛋白，60mmol/L咪唑下可見少許雜帶（66kD處），判斷可在之后的凝膠過濾層析中去除，故合并洗脫液。可見，該重組蛋白表達高、可溶性好且雜蛋白較少。

圖4 HspB-TEV-His蛋白的鎳柱親和層析

2.3 TEV蛋白酶酶切效果比較

柱上酶切法 經(jīng)SDS-PAGE分析（圖5），漂洗液中只有切除His標(biāo)簽的HspB（45kD），洗脫液中則存在酶切不完全仍帶有His標(biāo)簽的HspB-TEV-His（45kD）和TEV蛋白酶（27kD）。

透析酶切法 經(jīng)SDS-PAGE分析（圖5），流出液中有切除His標(biāo)簽的HspB蛋白和少量TEV蛋白酶，洗脫液中有未切開的HspB和TEV蛋白酶。

兩種酶切方法均可切除His標(biāo)簽，且保證較高的純度。對比兩者洗脫液，顯然在柱酶切中未切開的蛋白比透析酶切更多，說明透析酶切效率更高。

圖5 TEV蛋白酶酶切效果比較

2.4 HspB的凝膠過濾層析

Superdex200柱層析紫外吸收峰單一，峰型對稱陡峭，位置在56管（78.4mL）處，此處對應(yīng)于44kD，大小正確（圖6-A），取對應(yīng)峰位置的蛋白進行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，純化的蛋白為單一條帶（圖6-B），達到晶體初篩所要求的純度。收集峰尖位置左右的5管蛋白進行濃縮。

圖6 HspB的凝膠過濾層析

2.5 HspB蛋白結(jié)晶條件初篩

經(jīng)過大量的初篩條件篩選后，在Index 2試劑盒（Hampton Research）的第83個條件下有晶體生長，條件為25％ PEG3350，0.1mol/L Bis-Tris pH6.5，0.2mol/L MgCl2，14℃。晶體呈薄片狀，且有孿晶現(xiàn)象（圖7-A），不適合X-射線衍射數(shù)據(jù)收集，需要做進一步的優(yōu)化工作。

2.6 HspB蛋白結(jié)晶條件優(yōu)化

確定的最優(yōu)結(jié)晶條件是蛋白濃度7.5mg/mL，22％ PEG3350，0.1mmol/L Bis-Tris pH6.5，0.21mol/L MgCl2，18℃，1 50的比例加入晶種，蛋白溶液與下槽液體積比為2 1的條件下，能夠獲得立體的塊狀單晶（圖7-B），該晶體在上海光源進行X射線衍射后發(fā)現(xiàn)分辨率達到了1.8 ?。

圖7 HspB晶體的優(yōu)化

3 討論

本研究所采用經(jīng)典的QuickChange定點突變方法［19，20］（圖 2）：設(shè)計一對包含突變位點的引物，和模版質(zhì)粒退火后用Pfu聚合酶“循環(huán)延伸”（聚合酶按照模版質(zhì)粒延伸引物，一圈后回到引物5'端終止，再經(jīng)過反復(fù)加熱退火延伸的循環(huán)）。正反向引物的延伸產(chǎn)物退火后配對成為帶缺刻的開環(huán)質(zhì)粒。Dpn I酶切延伸產(chǎn)物，由于原來的模版質(zhì)粒來源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的，對Dpn I敏感而被切碎（Dpn I識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會出現(xiàn)，而且不止一次），而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒因無甲基化而未被切開，因此得以成功轉(zhuǎn)化（大腸桿菌體內(nèi)修復(fù)缺刻質(zhì)粒），即可得到突變質(zhì)粒的克?。?1］。前期實驗構(gòu)建了pET28a-HspB質(zhì)粒，表達純化得到HspB-His蛋白，用于結(jié)晶研究。由于晶體質(zhì)量較差，不能用于衍射［12］。蛋白C端序列存在超過30個氨基酸是非折疊區(qū)域（Foldindex預(yù)測），而這些氨基酸所形成的柔性肽段，會導(dǎo)致蛋白在構(gòu)象上的不均一，阻礙晶體的生長［15］。然而完全或部分去除這些序列會導(dǎo)致蛋白不表達或沉淀（數(shù)據(jù)未顯示），暗示著該序列對于HspB結(jié)構(gòu)有著穩(wěn)定作用。因此本研究選擇去除其C端的His標(biāo)簽（6×His短肽也是柔性肽），以提升蛋白晶體的質(zhì)量。

前期實驗嘗試插入凝血酶酶切序列，然后發(fā)現(xiàn)其無法被凝血酶切開。推測是由于其識別序列（Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser）較短，僅6個氨基酸，且前3個氨基酸（Leu、Val和Pro）均是非極性氨基酸，在表達時可能被折疊進了蛋白疏水核，沒有暴露在水環(huán)境中［22］；或者是由于其酶切位點在Arg和Gly間，由于空間位阻，導(dǎo)致無法切除目的氨基酸［23］。

本研究總結(jié)了前期實驗的經(jīng)驗，選擇了TEV蛋白酶作為工具酶，其主要考量在于：（1）其識別序列（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly）更長，為7個氨基酸，且除了Phe疏水外，其余氨基酸皆親水，不易被折疊進疏水核內(nèi)；（2）其酶切位點位于Gln和Gly間，離蛋白更遠，會減小空間位阻的影響。

TEV蛋白酶酶切時，需要解決了3個問題：（1）新增的步驟帶來的蛋白損失問題；（2）保持蛋白純度和性質(zhì)的問題；（3）純化路線的可操作性和時間問題。因此，本研究比較了柱上酶切和透析酶切的效率及純化效果發(fā)現(xiàn)，雖然在柱酶切比較省時省力，然而酶切效率較低，這可能是由于TEV蛋白酶與底物HspB蛋白都帶有His標(biāo)簽，因而結(jié)合在柱料上，發(fā)生的是固固反應(yīng)，分子間接觸幾率不如溶液反應(yīng)那么高，并且酶固定化后會降低酶活［24］；而透析酶切是溶液反應(yīng)，在酶切的同時進行咪唑濃度的稀釋，可以節(jié)省時間，方便下一步的鎳柱除雜。因此最后選擇了透析酶切的策略。

蛋白的均一性是由鎳柱除雜和凝膠過濾層析來保證的。鎳柱除去了未切開的HspB蛋白，保證產(chǎn)物中僅有不帶標(biāo)簽的HspB蛋白，這是無法通過凝膠過濾層析實現(xiàn)的。均一性對于蛋白結(jié)晶的影響是很大的，因此為了保持最大均一性，只取凝膠過濾層析中紫外吸收峰半峰對應(yīng)的5管蛋白進行濃縮點晶，而非整個紫外吸收峰對應(yīng)的蛋白［25］。這是由于均一性越高，其蛋白的大小形狀也越接近，在凝膠過濾層析中，也就越傾向于在同一位置出峰。

因此最終確定下來的純化路線能夠獲得純度高、較均一的HspB蛋白，并且沒有降解存在。同時整個純化過程都在4℃進行，在最終保存液中也添加了二硫蘇糖醇以保護蛋白。

培養(yǎng)得到的單晶在上海光源進行X射線衍射后發(fā)現(xiàn)，雖然分辨率達到了1.8 ?，但是在后續(xù)處理數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)其仍有孿晶趨勢，這可能是由于TEV蛋白酶酶切后留下的肽（Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln）具有一定的柔性所致，相比6×His標(biāo)簽，其在結(jié)晶條件（pH6.5）下帶電性更少，因而減少了同性相斥的現(xiàn)象，更利于蛋白分子有序堆積［26］。因此接下來將繼續(xù)優(yōu)化C端序列，進一步提高其構(gòu)象均一性。底物的存在有利于晶體的生長［27］，因此也將嘗試進行與底物的共結(jié)晶，進一步優(yōu)化晶體。HspB是惡臭假單胞菌尼古丁代謝通路中的關(guān)鍵酶，該途徑中其他酶的結(jié)構(gòu)多已見諸報道［28］，而HspB的結(jié)構(gòu)仍舊未知。了解HspB結(jié)構(gòu)不僅有助于理解其功能和結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系，完善整個吡咯途徑，還對定向進化提高酶活及進行工業(yè)化應(yīng)用具有積極的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本研究以惡臭假單胞菌HspB表達質(zhì)粒pET28a-HspB為模板，通過PCR插入TEV蛋白酶酶切序列，測序驗證重組質(zhì)粒pET28a-HspB-TEV-His。選用大腸桿菌BL21（DE3）進行表達，經(jīng)過鎳柱親和層析、TEV蛋白酶酶切、鎳柱除雜以及凝膠過濾層析獲得高純度蛋白。

優(yōu)化結(jié)晶條件后，確定了單晶培養(yǎng)條件是蛋白濃 度 7.5mg/mL，22％PEG3350、0.1mol/L Bis-Tris pH6.5、0.21mol/L MgCl2，18℃，以1 50的比例加晶種，蛋白溶液與下槽液體積比為2 1的條件；單晶的分辨率達到1.8 ?。

［1］Doolittle DJ, Winegar R, Lee JK, et al. The genotoxic potential of nicotine and its major metabolites［J］. Mutat Res, 1995, 344：95-102.

［2］Campain JA. Nicotine：potentially a multifunctional carcinogen？［J］. Toxicological Sciences, 2004, 79（1）：1-3.

［3］Hecht SS, Hochalter JB, Villalta PW, et al. 2’-Hydroxylation of nicotine by cytochrome P450 2A6 and human liver microsomes：formation of a lung carcinogen precursor［J］. Proceeding of the National Academy of SciencesUSA, 2000, 97（23）：12493-12497.

［4］Novotny TE, Zhao F. Consumption and production waste：another externality of tobacco use［J］. Tob Control, 1999, 8（1）：75-80.

［5］Wang SN, Xu P, Tang HZ, et al. Biodegradation and detoxification of nicotine in tobacco solid waste by a Pseudomonas sp. ［J］.Biotechnology Letters, 2004, 26（19）：1493-1496.

［6］Wang S, Liu Z, Tang H, et al. Characterization of environm-entally friendly nicotine degradation by Pseudomonas putida biotype A strain S16. ［J］. Microbiol, 2007, 153：1556-1565.

［7］Wang SN, Xu P, Tang HZ, et al. ‘Green’ route to 6-hydroxy-3-succinoyl-pyridine from（S）-nicotine of tobacco waste by whole cells of a Pseudomonas sp. ［J］. Environmental Science Technology, 2005,39：6877-6880.

［8］Tang H, Wang L, Wang W, et al. Systematic unraveling of the unsolved pathway of nicotine degradation in Pseudomonas［J］.PLoS Genet,2013, 9（10）：e1003923.

［9］Tang H, Wang S, Ma L, et al. A novel gene, encoding 185 6-hydroxy-3-succinoylpyridine hydroxylase, involved in nicotine degradation by Pseudomonas putida strain S16. ［J］Appl Environ Microbiol, 2008,74（5）：1567-1574.

［10］Tang H, Yao Y, Zhang D, et al. A novel NADH-dependent and FAD-containing hydroxylase is crucial for nicotine degradation by Pseudomonas putida［J］. J Biol Chem, 2011, 286：39179-39187.

［11］McPherson A. Crystallization of biological macromolecules［M］.1st ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

［12］胡傳明, 于浩, 唐鴻志, 等. 6-羥基-3-琥珀酰吡啶單加氧酶的純化與結(jié)晶條件［J］. 微生物學(xué)通報, 2014, 41（9）：1779-1784.

［13］Carson M, Johnson DH, McDonald H, et al. His-tag impact on structure［J］. Acta Cryst D, 2007, 63：295-301.

［14］Bergfors TM.Protein crystallization：techniques, strategies, and tips：a laboratory manual［M］. California：InternationalUniversity Line, 1999.

［15］Derewenda ZS, Vekilov PG. Entropy and surface engineering in protein crystallization［J］. Acta Cryst D, 2006, 62：116-124.

［16］Strong M, Sawaya MR, Wang S, et al. Toward the structural genomics of complexes：crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, 103（21）：8060-8065.

［17］Hall TMT, Porter JA, Young KE, et al. Crystal structure of a Hedgehog autoprocessing domain：homology between Hedgehog and self-splicing proteins［J］. Cell, 1997, 91（1）：85-97.

［18］Bauman JD, Das K, Ho WC, et al. Crystal engineering of HIV-1 reverse transcriptase for structure-based drug design［J］. Nucleic Acids Research, 2008, 36（15）：5083-5092.

［19］Zheng L, BaumannU, Reymond JL. An efficient one-step sitedirected and site-saturation mutagenesis protocol［J］. Nucleic Acids Research, 2004, 32（14）：e115.

［20］Li J, Li C, Xiao W, et al. Site-directed mutagenesis by combination of homologous recombination and DpnI digestion of the plasmid template in Escherichia coli［J］. Analytical Biochemistry, 2008,373（2）：389-391.

［21］Carter P. Site-directed mutagenesis［J］. Biochemical Journal,1986, 237（1）：1.

［22］Brondyk WH. Selecting an appropriate method for expressing a recombinant protein［J］. Methods Enzymol, 2009, 463：131-147.

［23］Estell DA, Graycar TP, Miller JV, et al. Probing steric and hydrophobic effects on enzyme-substrate interactions by protein engineering［J］. Science, 1986, 233（4764）：659-663.

［24］Mateo C, Palomo JM, Fernandez-Lorente G, et al. Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques［J］. Enzyme Microb Technol, 2007, 40：1451-1463.

［25］Rengachari S, Aschauer P, Sturm C, et al. Purification,crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a soluble variant of the monoglyceride lipase Yju3p from the yeast Saccharomyces cerevisiae［J］. Acta Crystallographica Section F ：Structural Biology Communications, 2015, 71（2）：242-245.

［26］Kantardjieff KA, Rupp B. Protein isoelectric point as a predictor for increased crystallization screening efficiency［J］. Bioinformatics,2004, 20（14）：2162-2168.

［27］Smits SHJ, Mueller A, Grieshaber MK, et al. Coenzyme-and Histag-induced crystallization of octopine dehydrogenase［J］. Acta Crystallogr F：Struct Biol Crystallization Commun, 2008, 64（9）：836-839.

［28］Chen D, Tang H, Lv Y, et al. Structural and computational studies of the maleate isomerase from Pseudomonas putida S16 reveal a breathing motion wrapping the substrate inside［J］. Molecular Microbiology, 2013, 87（6）：1237-1244.