黃錠 劉旭平 范里 趙亮 譚文松 陳則

采用動物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)流感疫苗，是將病毒適應到傳代細胞，并在生物反應器中大規(guī)模進行病毒繁殖以實現(xiàn)流感疫苗的規(guī)?；a(chǎn)。目前，這種工藝已經(jīng)逐步取代傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)技術，成為流感疫苗生產(chǎn)的主流工藝。然而，相對于日益增長的全球流感疫苗需求，這種生產(chǎn)工藝產(chǎn)能相對低下，因此提高工藝效率的研究工作勢在必行。近年來，應用于提高產(chǎn)率的手段多種多樣，主要涉及營養(yǎng)調(diào)節(jié)（維持培養(yǎng)基優(yōu)化、流加、灌注等）［1-4］、基因改造［5-7］和感染參數(shù)調(diào)整［感染復數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）、感染時間（Time of infection，TOI）等］［8］等幾個方面。

在基于MDCK細胞（Mardin-Darby kidney cells，MDCK）培養(yǎng)技術的流感疫苗生產(chǎn)工藝中，MDCK細胞是流感病毒的宿主細胞，流感病毒在細胞內(nèi)的擴增必然會受到感染時的細胞生理狀態(tài)的影響。生理狀態(tài)良好的細胞有利于病毒的感染復制，可提高流感病毒在細胞內(nèi)的擴增效率，而TOI是決定感染病毒時細胞生理狀態(tài)的關鍵因素。因此，TOI是流感疫苗生產(chǎn)工藝中一個重要的優(yōu)化參數(shù)。細胞在生長過程中其生理狀態(tài)是隨時間不斷變化的，其生產(chǎn)病毒的能力也會隨之發(fā)生相應改變。因此，考察細胞在何時處于感染復制病毒的最佳生理狀態(tài)成為一個關鍵研究點。當TOI較小時，細胞處于對數(shù)生長期時，細胞對應的生理狀態(tài)較好，此時可能有利于病毒感染復制。當TOI較大，細胞處于衰亡期時，細胞逐漸死亡，這對于病毒擴增過程可能造成不利影響［1，9-12］。然而，目前的研究工作大多僅涉及最適合TOI的選擇，而鮮見TOI對細胞生長、代謝與流感病毒擴增過程影響的研究［8，13］。因此，深入研究TOI對MDCK細胞生產(chǎn)流感病毒過程的影響機制，對于流感疫苗工藝的開發(fā)與優(yōu)化具有重要的意義。

本研究通過以H1N1流感病毒于不同TOI條件下感染MDCK細胞的方法，研究TOI對MDCK細胞生長、代謝以及流感病毒擴增過程的影響，以期能夠揭示TOI對MDCK細胞培養(yǎng)中流感病毒生產(chǎn)過程的作用機制，為基于動物細胞培養(yǎng)技術的流感疫苗生產(chǎn)工藝的開發(fā)與優(yōu)化工作提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株與培養(yǎng)基 本實驗所用的細胞株為犬腎上皮連續(xù)細胞系MDCK細胞，購自ATCC。細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基補加10％（V/V）胎牛血清（購自美國Gibco公司）和3700mg/L碳酸氫鈉（購自美國Sigma-Aldrich公司）的DMEM培養(yǎng)基（購自美國Gibco公司）。流感病毒生產(chǎn)階段所用維持培養(yǎng)基為添加5mg/L 經(jīng)甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）處理的胰蛋白酶（購自美國Sigma-Aldrich公司）的DMEM培養(yǎng)基。

1.1.2 病毒株 WHO推薦的甲型流感病毒株A/California/7/2009（H1N1）X-179A， 購 于 英 國 國家生物標準與檢定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）。該病毒為以模式甲型流感A/PR8/34病毒株為骨架，含2009年流行的豬流感病毒抗原蛋白基因的重組病毒株。病毒原液為在SPF雞胚中收獲的尿囊液，其半組織感染滴度TCID50值為 5.62×108TCID50/mL。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 種子細胞用方瓶貼壁培養(yǎng)，待種子細胞足夠時于攪拌瓶中以微載體懸浮培養(yǎng)進行接毒實驗。方瓶培養(yǎng)：從細胞庫中復蘇MDCK細胞，以4×104-5×104cells/cm2細胞密度接種于方瓶（購自美國Corning公司）中，置于 37℃、5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，作為實驗用的種子細胞。待MDCK細胞生長至鋪滿方瓶底部約80％-90％后，去掉培養(yǎng)液，用不含鈣鎂的無菌磷酸緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）（0.2mL/cm2）漂洗細胞；然后于室溫下用含0.25％（W/V）胰蛋白酶（購自Gibco公司）和 0.05％（W/V）EDTA（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（購自Sigma-Aldrich公司）的無菌消化液（0.2mL/cm2）消化細胞30-60s；棄消化液后，置于5％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱37℃孵育至細胞收縮變圓，輕搖方瓶細胞即可脫落；加入新鮮培養(yǎng)基輕柔吹打均勻后傳代，接種密度為4×104-5×104cells/cm2。

微載體攪拌瓶培養(yǎng)：微載體CytodexTM1（購自美國GE-Healthcare公司）用PBS浸泡3次，每次浸泡30min，滅菌后待用。接種MDCK細胞至裝有微載體的無菌500mL攪拌瓶（購自美國Corning公司）中，接種細胞密度為2×105-3×105cells/mL，微載體用量為2g/L，培養(yǎng)液體積為200mL。置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中，攪拌瓶轉速設為50r/mim。

1.2.2 病毒感染 細胞培養(yǎng)至實驗既定時間（TOI，視具體實驗設計而定），去除上清，以等培養(yǎng)體積的PBS洗滌細胞兩次以除去殘留血清蛋白及抑制性代謝物，加入等體積含病毒原液（MOI=0.01，以病毒原液TCID50值為依據(jù)［14］）和維持培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。

1.2.3 MOI確定方法 根據(jù)劉鵬等［15-17］的方法，以不同 MOI（1、0.01、0.001、0.0001和 0.00001）接種病毒原液感染以微載體培養(yǎng)生長良好的MDCK細胞，血凝滴度實驗（Hemagglutination assay，HA）結果顯示MOI為0.01時病毒HA滴度最高，表明接種劑量選擇MOI=0.01為最佳，故本實驗MOI采用0.01。1.2.4 取樣及樣品處理 培養(yǎng)過程中每12h取樣，計數(shù)細胞。培養(yǎng)懸液經(jīng)300×g離心10min后取上清于-20℃保存，用于檢測營養(yǎng)物和代謝副產(chǎn)物濃度。上清存-80℃用于測定流感病毒血凝滴度。

2.1 Survivin基因表達與喉癌患者臨床病理特征的關系 126例喉癌癌組織標本中共檢出Survivin陽性86例，陽性率為68.3%(86/126)。Survivin陽性組年齡、性別、腫瘤部位與Survivin陰性組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、中低分化、淋巴結轉移患者比例顯著高于Survivin陰性組(P<0.05)，見表1。

1.2.5 細胞計數(shù) 傳代時細胞經(jīng)消化后以臺盼藍拒染法計數(shù)。具體來說，培養(yǎng)好的貼壁細胞消化后，用新鮮的培養(yǎng)基將細胞按一定比例制成細胞懸液。以0.5mL加入24孔板一孔中，加入0.5mL 0.4％臺盼藍染液，染色2-3min后吸取少許懸液涂于血球計數(shù)板上，加上蓋玻片，鏡下對每個視野分別計死細胞和活細胞數(shù)。微載體培養(yǎng)的細胞以結晶紫染核法計數(shù)。其方法為，取1mL含鋪有細胞的微載體的培養(yǎng)液，沉降棄上清，以不含鈣鎂的磷酸緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）洗滌一遍，去除上清，加入與上清等體積的結晶紫裂解染色液，搖床上37℃孵育4h。經(jīng)處理，微載體上細胞被裂解，細胞核釋放到上清中并被結晶紫染色。將此懸液吹打均勻后用PBS緩沖液以適當倍數(shù)稀釋，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞核即為活細胞數(shù)。計數(shù)所需試劑均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2.6 營養(yǎng)物及代謝副產(chǎn)物濃度測定 培養(yǎng)液中營養(yǎng)物葡萄糖、谷氨酰胺和代謝副產(chǎn)物乳酸、氨的濃度使用生化分析儀Bioprofile 400analyzer（購自美國Nova biomedical公司）測定。

1.2.7 流感病毒血凝滴度測定 采用血凝滴度實驗HA試驗方法測定。配置雞紅細胞懸液，使懸液中的紅細胞密度控制在2.0×107cells/mL左右。在每個孔中加入50μL配置好的雞紅細胞懸液，振蕩器上振蕩混勻，室溫下靜置20-30min后，觀察其結果［18］。每個樣品同時平行測試2遍，結果取平均值。所需96孔微量反應板購自Corning公司，雞紅細胞由上海生物制品研究室有限責任公司提供。

1.2.8 計算方法 細胞比生長速率計算：

其中，μ：比生長速率（h-1），VCD：活細胞密度（cells/mL），t為時間（h）。

其中，IVCC：活細胞密度對時間的積分（109cells·d/L）；i：葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸或氨；Qi：0到t期間物質(zhì)的比消耗速率或比生產(chǎn)速率mmol/（109cells·d）；△i：0到t期間i物質(zhì)單位體積的消耗或生成量（mmol/L）。

計算乳酸對葡萄糖的轉化率Ylac/gluc（mmol/mmol）及氨對谷氨酰胺的轉化率Yamm/gln（mmol/mmol）：

單位細胞病毒產(chǎn)率（svy）的計算［19］：

式中：Vi：收獲病毒時的體積（mL），RBC（Red blood cell）：紅細胞密度（cells/mL），WV（Working volume）：工作體積（mL），Xv：受感染的活細胞密度（cells/mL），αHAi：血凝值檢測最高的 HA 效價（HA units/50μL）。

2 結果

2.1 TOI對感染H1N1流感病毒后MDCK細胞生長的影響

將 MDCK細胞培養(yǎng)至 24、48、60、72、84和96h后感染H1N1流感病毒（即TOI分別為24、48、60、72、84和96h），考察TOI對感染H1N1流感病毒后MDCK細胞生長的影響，結果如圖1所示。

各TOI條件下，感染時活細胞密度CCI（Cell concentration at infection，CCI）為（1.49±0.04）×106cells/mL、（3.01±0.20）×106cells/mL、（4.28±0.12）×106cells/mL、（5.19±0.25）×106cells/mL、（5.57±0.01）×106cells/mL 和（5.52±0.13）×106cells/mL。TOI=24h與 TOI=48h組在感染后12h（12hpi）內(nèi)，細胞密度分別增加（14.61±7.38）％和（21.57±2.62）％，該階段比生長速率均為正值；隨后細胞密度快速下跌，比生長速率變?yōu)樨撝?，前者細胞密?0hpi跌至0，后者細胞密度72hpi跌至0。TOI=60h組0-24hpi細胞密度緩慢下跌，該階段平均比生長速率為-0.003h-1；隨后下跌速度加劇，72hpi跌至0。TOI=84h與96h組，細胞密度自0hpi起便快速下跌，無增長期或緩慢下跌期。

計算0-48hpi平均死亡速率（圖1-C）可知，TOI小于60h時，細胞比死亡速率隨TOI增加而減??；當TOI大于60h時，細胞比死亡速率隨TOI增加而增加。

圖1 不同TOI條件下MDCK細胞的活細胞密度（A）、比生長速率（B）和0-48hpi平均比死亡速率（C）

2.2 TOI對感染H1N1流感病毒后MDCK細胞代謝的影響

同時，本實驗也考察了TOI對感染H1N1流感病毒后MDCK細胞代謝的影響，結果如圖2所示。TOI小于60h時，葡萄糖比消耗速率（-Qgluc）隨TOI增加而大幅下跌；TOI小于60h時，-Qgluc隨TOI變化幅度減小。TOI小于48h時，谷氨酰胺的比消耗速率（-Qgln）隨TOI增加大幅下跌；TOI大于48h時，-Qgln變化幅度較小。對于乳酸和氨這兩種代謝產(chǎn)物，TOI小于72h時生成速率（Qlac和Qamm）隨TOI增加而大幅下跌；TOI大于72h，Qlac和Qamm代謝速率很小。

另外，計算乳酸對葡萄糖的轉化率（Qlac/（-Qgluc））與氨對谷氨酰胺的轉化率（Qamm/（-Qgln）），結果表明，隨著 TOI增大，Qlac/（-Qgluc）逐漸增大，而Qamm/（-Qgln）逐漸減小（圖 2-B）。

2.3 TOI對MDCK細胞中H1N1流感病毒擴增過程的影響

TOI對H1N1流感病毒在MDCK細胞中擴增過程的影響如圖3所示。圖3-A和3-B顯示，TOI=24h組 HA 滴度至 24hpi達到 2.56×102HA units/50μL，隨后至 48hpi達峰值 6.09×102HA units/50μL，72hpi時略有下降；TOI設為48h，至24hpi病毒HA滴度僅為 1.28×102HA units/50μL，48hpi達到最大值7.24×102HA units/50μL，72hpi時下跌；TOI為 60h，24hpi時 HA滴度為（3.84±1.81）×102HA units/50μL，48hpi達最大值（8.74±2.12）×102HA units/50μL，72hpi下降 ；TOI為 72h，24hpi時 HA 滴度為5.12×102HA units/50μL，48hpi達最大值 1.02×103HA units/50μL，72hpi略 降 ；TOI為 84h 和 96h，HA滴度亦于48hpi達最大值，但最大值均低于TOI=72h組。進一步計算（圖3-C）得知，單位細胞病毒產(chǎn)率svy隨TOI增大而降低。而且，TOI=72h時獲得的HA滴度最高，svy卻并非最高。隨著TOI增加，感染前細胞密度CCI呈上升趨勢，而對應svy則呈下降趨勢（圖3-C）。

圖2 不同TOI條件下MDCK代謝速率（A）及葡萄糖和谷氨酰胺轉化效率（B）

圖3 不同TOI條件下MDCK中H1N1流感病毒滴度隨時間變化（A）、最大滴度（B）和單位細胞病毒產(chǎn)率（C）

2.4 不同TOI條件下CCI對單位細胞病毒產(chǎn)率的影響

據(jù)上述圖3-C結果，有必要進一步考察TOI、CCI與svy的關系。本實驗將取自不同培養(yǎng)時間（TOI=24、36、48、60和 72h）的細胞濃縮或稀釋至不同細胞密度梯度，即每個TOI條件下設置1×106-5×106cells/mL 5個細胞密度梯度，考察各實驗組svy值。圖4顯示，當TOI相同時，不同CCI條件下svy值基本不變；而當CCI相同時，svy隨TOI增加而降低。

3 討論

近年來，全世界對流感疫苗的需求量在飛速增長。相較之下，以動物細胞培養(yǎng)方法為基礎的流感病毒疫苗生產(chǎn)工藝的產(chǎn)能則相對低下，成為制約這種新興工藝發(fā)展的一個瓶頸因素［20］。因此，提高生產(chǎn)效率一直是該類工藝開發(fā)與優(yōu)化工作的重點。在眾多的考察因素中，感染參數(shù)TOI是一個重要考察對象。然而，目前工作大多僅涉及最適合TOI值的選擇［13，21］，而少有研究TOI值對工藝過程影響機制。據(jù)此，本研究通過設置不同TOI條件，研究了其對細胞生長、代謝與流感病毒擴增過程影響，以及TOI、CCI與svy之間的關系。

圖4 不同TOI與CCI條件下MDCK細胞中單位細胞病毒產(chǎn)率

首先，考察了TOI的設定值對被流感病毒感染后的MDCK細胞的生長和代謝的影響。通過上述研究結果可以發(fā)現(xiàn)，TOI的設定值會影響細胞死亡速率，TOI值過小或過大均會使被H1N1流感病毒感染的MDCK細胞死亡速率加快。推測其原因可能為：當TOI過小時，細胞密度較小，細胞之間結合比較疏松，且細胞伸展到微載體表面，導致細胞體積大，表面積大［22］，因而更容易被病毒感染脫落死亡或被TPCK-胰酶影響［23，24］；相反，TOI過大，細胞衰老，代謝廢物累積等原因造成細胞很脆弱，甚至出現(xiàn)凋亡，同時病毒感染又會加劇凋亡過程，所以細胞死亡速率快。同時，TOI設定值不同，也會導致細胞代謝速率出現(xiàn)很大差異。結果表明，被感染后的細胞的對Gluc、Gln、Lac和Amm等物質(zhì)的代謝速率會隨著TOI值的增大而減緩。在細胞生長過程中，細胞之間相互作用，胞內(nèi)各種代謝相關的酶活均會不斷變化［22，25］，最終導致不同TOI條件下細胞對各種營養(yǎng)代謝物的代謝速率不同。綜合這兩方面結果，不同TOI條件下，感染前細胞維持培養(yǎng)的時間長短不一，從而導致細胞密度不同、營養(yǎng)物的消耗量和代謝副產(chǎn)物的累積量不同。另外不容忽視的一點，不同TOI條件下感染流感病毒后MDCK細胞對乳酸對葡萄糖的轉化率和氨對谷氨酰胺的轉化效率也會有很大差別。Qlac/（-Qgluc）隨TOI設定值的增加而增大，表明隨著TOI的增大，進入三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA）的 Gluc減少，Gluc的產(chǎn)能效率降低；而Qamm/（-Qgln）逐漸減小，表明隨著TOI的增大，進入TCA的Gln增多，Gln的產(chǎn)能效率提高［25］。如前所述，培養(yǎng)后期細胞變得脆弱甚至出現(xiàn)凋亡，并且病毒擴增過程也會導致細胞凋亡。而凋亡過程會致使線粒體膜通透性增加，出現(xiàn)能量缺陷［26］，需要更多的 Gluc 進入糖酵解來補充能量［27］，同時生成乳酸［25］。與此同時，更多的Gln進入回補TCA途徑，待Gln耗竭，便會誘導谷氨酰胺合酶活性，通過谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，從而導致Qamm/（-Qgln）逐漸減?。?5］。另外，氨氣通過培養(yǎng)基揮發(fā)逃逸可能也是原因之一。綜上分析，MDCK細胞的生長狀態(tài)、代謝速率及代謝效率均有很大差別，表明不同TOI條件下MDCK細胞的狀態(tài)也會有很大差別。

另外，通過考察TOI對流感病毒擴增過程的影響發(fā)現(xiàn)，TOI不同，則病毒的產(chǎn)量和單位細胞病毒產(chǎn)率也會有很大差別。更值得注意的一點，在此實驗條件下CCI越高svy越低，這與文獻中提到的“細胞密度效應”極為相似［19，28］。但經(jīng)進一步研究TOI、CCI、svy 三者之間的關系可知，當保持TOI不變時，這種“細胞密度效應”則不復存在。換言之，svy高低更大程度上取決于TOI值的大小。縱觀全文研究結果，TOI之所以能對MDCK細胞中H1N1流感病毒擴增過程產(chǎn)生顯著影響，其根源在于不同TOI條件下細胞自身狀態(tài)有很大差別［21］。據(jù)此，在今后的工藝開發(fā)工作中，可以不再受限于TOI，而通過人為合理調(diào)控細胞狀態(tài)的手段來提高流感病毒生產(chǎn)效率。但細胞狀態(tài)變化所包含的因素錯綜復雜，而且目前對其界定也尚未十分明確。TOI不同可能會導致細胞表面病毒受體、細胞周期分布、細胞凋亡、信號轉導機制、營養(yǎng)組分濃度、代謝毒物積累程度以及其它未知微環(huán)境等眾多因素發(fā)生變化［3，13，19，29］，這些都有待進一步詳細考察。

4 結論

在不同TOI條件下以H1N1流感病毒感染MDCK細胞，考察TOI對MDCK細胞生長與代謝動力學以及H1N1流感病毒擴增過程的影響。結果表明，雖將TOI設置為72h時H1N1流感病毒產(chǎn)量最高，但svy卻隨TOI增大而呈現(xiàn)下降趨勢。繼而考察TOI、CCI與svy三者之間關系可知，該現(xiàn)象是由TOI不同所引起的細胞狀態(tài)改變所致，而非僅由高細胞密度導致。該研究揭示了由TOI不同導致的細胞狀態(tài)差異對MDCK細胞中H1N1流感病毒生產(chǎn)效率的重要性，表明有望通過調(diào)整細胞狀態(tài)的手段優(yōu)化動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗的工藝以提高生產(chǎn)效率。

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