馬金彪 張大勇 張梅茹 肖薪龍 張選 李麗

鉀（K）、鈉（Na）是植物生長(zhǎng)過(guò)程中重要的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)維持細(xì)胞的滲透壓、調(diào)節(jié)葉片和氣孔運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞伸長(zhǎng)等具有重要作用［1］，K+/Na+比是衡量植物是否具有耐鹽特性的重要指標(biāo)之一［2］，植物細(xì)胞質(zhì)中的Na+是重要的毒性決定因子，在鹽漬條件下，過(guò)量Na+對(duì)植物是有害的［3］，大量的Na+會(huì)限制K+的吸收［4］，從而影響K+/ Na+比，因此保持細(xì)胞內(nèi)相對(duì)較高的K+含量對(duì)植物的生長(zhǎng)至關(guān)重要。HKT類蛋白是一種高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體，廣泛存在于植物、真菌、真細(xì)菌和古細(xì)菌中，對(duì)于維持生物體內(nèi)K+/ Na+比具有重要作用［5］。

Schachtman等［6］從小麥中克隆得到第一個(gè)HKT基因，以后陸續(xù)在水稻、擬南芥、冰葉日中花、海篷子等多種植物中克隆了其同源蛋白基因。大量研究表明，HKT類蛋白根據(jù)其功能可以分為兩類，一種是以小麥TaHKT1、水稻OsHKT2、冰葉日中花McHKT1等為代表，為K+/Na+共轉(zhuǎn)運(yùn)體，其對(duì)兩種離子具有高選擇性，當(dāng)兩種離子都存在且Na+濃度較低時(shí)，同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)這兩種離子，是一種Na+偶聯(lián)的K+吸收載體，當(dāng)K+濃度較低而Na+濃度較高時(shí)，介導(dǎo)低親和的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)而高親和K+吸收受到阻遏［7］，Su等［8］利用蛋白免疫定位技術(shù)發(fā)現(xiàn)McHKT1在葉片的液泡處有較強(qiáng)的表達(dá)信號(hào)，這一發(fā)現(xiàn)表明該蛋白在鹽生植物中起調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)離子平衡的作用；另一種則是以擬南芥為代表的AtHKT1蛋白，其主要在根中表達(dá)［9］，越來(lái)越多的證據(jù)表明HKT類蛋白不是作為一種高親和K+吸收載體在起作用，可能作為一種重要的Na+內(nèi)流系統(tǒng)在起作用，且對(duì)Na+吸收起調(diào)控作用［10］。然而，目前對(duì)于HKT類蛋白在鹽生植物耐鹽特性上的機(jī)制仍然研究較少，本研究以鹽生植物鹽角草為材料，利用RACE技術(shù)克隆K+離子相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體SeHKT1基因全長(zhǎng)cDNA 序列，結(jié)合生物信息學(xué)方法分析其可能的跨膜特性和親和特性，且利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)SeHKT1在不同脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行初步分析，為在分子水平上揭示鹽生植物Na+、K+選擇性吸收、耐鹽機(jī)理及通過(guò)基因工程手段培育耐鹽作物新品種，改良鹽堿地提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽角草（Salicornia europaea L.）種子由中國(guó)科學(xué)院阜康荒漠生態(tài)站提供。

1.2 方法

1.2.1 材料的處理和培養(yǎng) 鹽角草種子播種于滅菌的蛭石培養(yǎng)基中，在溫室中培養(yǎng)，晝夜溫度為25℃/20℃，Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液澆灌，光照16h，光強(qiáng)度 200μmol/（m2·s），相對(duì)濕度是 60％-70％，鹽角草長(zhǎng)至3cm左右時(shí)進(jìn)行疏苗，每盆保留20株左右，生長(zhǎng)2個(gè)月后分別用0、10、200、500和800mmol/L NaCl進(jìn)行脅迫處理，適時(shí)補(bǔ)充溶液，200mmol/L NaCl處理的植株在6、24、48、72和120h進(jìn)行地上部和根部分別取樣，其余4個(gè)處理均在72h后取樣，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SeHKT1基因部分編碼序列的獲得 TIANGEN RNA試劑盒提取鹽角草0和200mmol/L NaCl處理的地上部及根部總RNA，將兩種RNA混合作為模板反轉(zhuǎn)為cDNA，根據(jù)鹽角草轉(zhuǎn)錄組Unigene測(cè)序結(jié)果（由華大基因測(cè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)）用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物SeHKT1：正向引物：5'-AATGGAATGGAGTAATGAAGGA-3'；反向引物：5'-TATGTGGGAAATGAATGGGCTA-3'。PCR擴(kuò)增程序：95℃變性4min；95℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 1min，36 個(gè)循環(huán) ；72℃延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、連接pMD18-T vector（TaKaRa），經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性菌落篩選后，提取陽(yáng)性質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.3 5'-RACE及3'-RACE 利用SMARTer RACE cDNA Amplification kit試劑盒（Clontech），以鹽角草0和200mmol/L NaCl處理的地上部及根部混合RNA為模板合成5'-Ready cDNA和3'-Ready cDNA。根據(jù)所獲得的SeHKT1基因部分cDNA序列，設(shè)計(jì)RACE特異性引物。5'端 SeHKT1（5）：5'-ACGACCAAC ATAGCTGGTGCAATGGAGG-3'及 5'端的巢式引物SeHKT1（Nest 5）：5'-CCAACATAGCTGGTGCAAT GGAGGAAAG-3'；3'端 SeHKT1（3）：5'-TGGTATG GATTTGCAGGGAGGTGGAGTG-3'及3'端的巢式引物 SeHKT1（Nest 3）：5'-GGATTTGCAGGGAGGTGG AGTGACCAAG-3'。第一輪反應(yīng)條件是：95℃ 4min；95℃ 30s，68℃ 45s，72℃ 2min，5 個(gè)循環(huán) ；95℃30s，66℃ 45s，72℃ 2min，5 個(gè)循環(huán) ；95℃ 30s，64℃ 45s，72℃ 2min，35 個(gè)循環(huán) ；72℃ 10min。通過(guò)第二輪巢式PCR獲得末端擴(kuò)增產(chǎn)物，分離純化此PCR產(chǎn)物后連接pMD19-T載體并測(cè)序。

1.2.4 鹽角草SeHKT1基因 cDNA全長(zhǎng)的獲得 測(cè)序結(jié)果用DNAMAN和NCBI網(wǎng)站上的Blast比對(duì)工具進(jìn)行分析和拼接得到SeHKT1全長(zhǎng)序列1761bp。從全長(zhǎng)序列兩端設(shè)計(jì)引物：SeHKT1-S：5'-AAAATCCTCTTGTACTCCATTAAGC-3'，SeHKT1-A ：5'-GTTTTAGAGGAGTTTCCAAGCTTTG-3'。 按 照 程 序 95℃ 4min ；95℃ 30s，54℃ 45s，72℃ 2min，35 個(gè)循環(huán) ；72℃ 10min進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增，分離純化PCR產(chǎn)物后連接pMD19-T載體并測(cè)序，進(jìn)一步確認(rèn)測(cè)序拼接結(jié)果。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 通過(guò)MEGA5.1對(duì)HKT類蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類分析，利用ProtParam tool（http ：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）分析SeHKT1蛋白分子量和理論等電點(diǎn)，利用TMHMM Serverv 2.0及 TMpred（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）分析該蛋白序列跨膜區(qū)和跨膜方向，利用Protscale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析氨基酸序列疏水性，利用InterProScan（http ：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

1.2.6 SeHKT1基因的實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析 利用RNA植物提取試劑盒（QIANGEN）分別提取200mmol/L NaCl處 理 6、24、48、72、120h及 0、10、500、800mmol/L NaCl處理地上部和根部總RNA，0mmol/L NaCl處理作為對(duì)照，以鹽角草Tubulin基因作為內(nèi)參，引物序列為：SeTubulin-S：5'-AGGTCAACAAAGACAGCA-3'；SeTubulin-A：5'-AGCGAAAATGAGAGAGTG-3'。根據(jù)上述獲得的SeHKT1基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)定量引物：SeHKT1r-F：5'-CTATCTTGCCATCTTCACCATTATT-3'，SeHKT1r-R ：5'-GTCACTCCACCTCCCTGC-3'。按照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（TaKaRa）操作 ：95℃ 30 s；95℃ 5s，60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，添加熔解曲線程序（從65℃-95℃，每5 s增加0.5℃并讀取熒光值一次）。反應(yīng)混合液在Bio-Rad熒光定量96孔PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，所有的樣品都設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后獲得SeHKT1和內(nèi)參基因SeTubulin在各個(gè)樣品的Ct值（threshold cycle），按照 2-△△Ct方法［11］對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算基因在各個(gè)樣品中的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 SeHKT1基因部分序列的獲得

根據(jù)前期本實(shí)驗(yàn)室鹽角草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果獲得的片段設(shè)計(jì)正反向引物，利用高保真酶擴(kuò)增獲得800bp左右的PCR產(chǎn)物（圖1-A），克隆并測(cè)序后提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast分析，發(fā)現(xiàn)SeHKT1基因與畢氏海篷子SbHKT1基因、鹽地堿蓬SsHKT1基因氨基酸序列相似性較高，分別為95％、76％、62％和52％，故推測(cè)該片段為鹽角草HKT1基因的部分序列，故命名為SeHKT1。

2.2 SeHKT1基因cDNA末端RACE產(chǎn)物

5' RACE PCR擴(kuò)增出3條帶（圖1-B），測(cè)序后通過(guò)BLAST及DNAMAN軟件分析表明第一條1.2 kb左右的條帶是SeHKT15'端序列，3' RACE巢式PCR擴(kuò)增出750bp左右的預(yù)期產(chǎn)物（圖1-C）。

圖1 SeHKT1基因的PCR擴(kuò)增

2.3 SeHKT1基因完整開(kāi)放閱讀框（ORF）的獲得

利用軟件DNAMAN將SeHKT1 cDNA的5'端和3'端測(cè)序結(jié)果，與已知的SeHKT1基因部分編碼序列拼接，利用NCBI中的Open Reading Frame Finder工具分析得到1653bp完整的ORF（GenBank登錄號(hào)為KP739261），編碼550個(gè)氨基酸。從ORF兩端設(shè)計(jì)引物對(duì)cDNA擴(kuò)增并測(cè)序，進(jìn)一步確認(rèn)SeHKT1的全長(zhǎng)序列（圖1-D）。

2.4 SeHKT1基因生物信息學(xué)分析

2.4.1 SeHKT1基因蛋白同源性分析 NCBI中Blast分析顯示該蛋白與畢氏海篷子SbHKT1、鹽地堿蓬SsHKT1、冰葉日中花McHKT2、赤桉EcHKT1、EcHKT2氨基酸序列同源性分別為95％、76％、62％和52％。應(yīng)用MEGA5.1軟件對(duì)HKT類蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類分析也表明，SeHKT1與畢氏海篷子SbHKT1、鹽地堿蓬SsHKT1、冰葉日中花McHKT2、赤桉 EcHKT1、EcHKT2、大麥 HvHKT1；5、水稻OsHKT7屬于一組，同源性較高；水稻OsHKT1、OsHKT3、OsHKT9與小麥TaHKT1、蘆葦PhaHKT1一組，OsHKT4、OsHKT6與HsHKT4為一組（圖2）。

圖2 SeHKT1蛋白與其他物種HKT類蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

圖3 SeHKT1跨膜分析

2.4.2 SeHKT1蛋白特性、結(jié)構(gòu)域及跨模性分析 利用ProtParam tool分析SeHKT1蛋白分子量為62.41kD，理論等電點(diǎn)為9.35，帶正電荷的氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）總數(shù)為36個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（精氨酸和賴氨酸）總數(shù)為54個(gè)，該蛋白的穩(wěn)定指數(shù)為34.89，說(shuō)明該蛋白較穩(wěn)定。經(jīng)TMHMN（圖3-A）及TMpred（圖3-B）共同分析推測(cè)SeHKT1具有10個(gè)跨膜區(qū)（12-34，44-66，117-139，209-231，244-266，281-303，337-359，440-462，477-499），跨膜區(qū)長(zhǎng)度均為23個(gè)氨基酸殘基。InterProScan軟件分析SeHKT1具有一個(gè)信號(hào)肽序列（1-35）和一個(gè)TrkH家族特征序列（199-539），具有跨膜運(yùn)輸活性和陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體結(jié)合位點(diǎn)，因此推測(cè)SeHKT1為跨膜運(yùn)輸?shù)鞍?。通過(guò)ProtScale工具分析（圖4）顯示，該蛋白在N端、C端及跨膜區(qū)均存在明顯的疏水區(qū)（11-67，8-143，200-236，241-265，271-306，334-357，390-414，446-467，477-493，521-540），ProtParam tool分析該蛋白氨基酸的平均疏水性為0.376，表明該蛋白具有強(qiáng)烈的疏水性，符合載體蛋白的特點(diǎn)。

圖4 SeHKT1 疏水性分析

2.5 SeHKT1基因在鹽脅迫下表達(dá)分析

由圖5-A顯示，SeHKT1基因主要在根部表達(dá)，在地上部表達(dá)相對(duì)較低，無(wú)鹽條件下在地上部表達(dá)量極低。NaCl處理?xiàng)l件下該基因在地上部和地下部的表達(dá)均明顯增加，說(shuō)明該基因受鹽誘導(dǎo)表達(dá)；隨著NaCl處理濃度的增加，SeHKT1在根部表達(dá)量在10mmol/L濃度下最高，隨NaCl濃度升高，表達(dá)量逐漸降低。而在地上部，SeHKT1在200mmol/L NaCl處理下表達(dá)量最高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖5-A）。地下部直接接觸外界鹽脅迫，因此SeHKT1的響應(yīng)更為敏感和快速，而在地上部響應(yīng)則相對(duì)遲鈍。在200mmol/L NaCl處理下（圖5-B），SeHKT1主要在地下部表達(dá)，處理6h該基因在地下部表達(dá)量達(dá)到最高峰，24h后開(kāi)始下降；而地上部SeHKT1表達(dá)量緩慢提高，直到48h達(dá)到最高值。此外，該基因在地上部的表達(dá)量在200mmol/L NaCl處理時(shí)最高（圖5-A）。在鉀饑餓的條件下該基因在根部和地上部的表達(dá)均明顯升高，在地下部的表達(dá)量仍高于地上部，組織的差異表達(dá)結(jié)果與上文一致（圖5-C）。

3 討論

鹽角草是已知最耐鹽的高等植物之一，不僅能夠忍受1000mmol/L的NaCl［12］，而且需要一定的鹽分來(lái)維持其最適生長(zhǎng)［13］。鹽角草需要具備一定的細(xì)胞及分子水平的調(diào)控策略以適應(yīng)長(zhǎng)期生長(zhǎng)的鹽漬環(huán)境。因此，研究鹽角草的耐鹽機(jī)制及挖掘耐鹽基因具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 SeHKT1 在不同處理下不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

目前已經(jīng)有研究證明在許多植物物種中HKT（High-affinity K+Transporter）基因家族成員在調(diào)控細(xì)胞免受Na+毒害機(jī)制上發(fā)揮重要作用［14］。鹽角草具備有效的離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力并將其區(qū)隔化到液泡中［1］，以避免Na+對(duì)細(xì)胞器的損害。SeHKT基因家族能夠調(diào)控Na+和K+轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞內(nèi)K+/ Na+穩(wěn)態(tài)，可推測(cè)該基因家族對(duì)鹽角草的耐鹽性具有重要貢獻(xiàn)。

本研究利用鹽角草轉(zhuǎn)錄組Unigene序列及RACE擴(kuò)增技術(shù)成功獲得了一條HKT全長(zhǎng)基因，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類分析暫命名為SeHKT1。利用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)，SeHKT1蛋白具有10個(gè)跨膜域，一個(gè)信號(hào)肽序列（1-35）和一個(gè)TrkH家族特征序列（199-539），具有跨膜運(yùn)輸活性和陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體結(jié)合位點(diǎn)，在N端、C端及跨膜區(qū)均存在明顯的疏水區(qū)，符合跨膜運(yùn)輸載體的特點(diǎn)。通過(guò)生物信息學(xué)分析，可預(yù)測(cè)基因的功能，編碼蛋白的特性，為后續(xù)基因功能的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)指明了方向。

本研究通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)鹽角草SeHKT1基因在不同組織，不同處理時(shí)間，不同濃度NaCl及K+缺失條件下的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，SeHKT1主要在根中表達(dá)，高鹽和鉀饑餓誘導(dǎo)條件下，表達(dá)量均升高，尤其是在根部能對(duì)NaCl脅迫和K+缺失快速響應(yīng)，通過(guò)提高基因表達(dá)量來(lái)增強(qiáng)K+/Na+運(yùn)輸載體功能。200mmol/L NaCl濃度是鹽角草生長(zhǎng)的最適濃度［15］，該條件下根部組織被處理6h時(shí)SeHKT1基因被快速誘導(dǎo)表達(dá)，但在24h后表達(dá)量開(kāi)始逐漸下降，在48h后該基因相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照，表明SeHKT1基因能夠短時(shí)間內(nèi)響應(yīng)外界環(huán)境Na+離子的變化而上調(diào)表達(dá)，吸收一定量的Na+離子進(jìn)入鹽角草細(xì)胞內(nèi)，以維持一定的滲透壓平衡。大量的研究也表明，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中鹽生植物演化出一套完整的適應(yīng)高鹽環(huán)境機(jī)制［16］，其內(nèi)外的滲透壓主要靠大量Na+來(lái)調(diào)節(jié)［17］，因此一定濃度的NaCl會(huì)促進(jìn)鹽生植物的生長(zhǎng)，在高鹽環(huán)境下，其細(xì)胞中K+含量及胞質(zhì)中K+/Na+比幾乎不受影響［10］，推測(cè)鹽生植物細(xì)胞內(nèi)離子平衡調(diào)節(jié)與HKT類蛋白密切相關(guān)。低鹽條件下（10mmo/L）SeHKT1 在根部的相對(duì)表達(dá)量較高，這可能與吸收更多Na+維持體內(nèi)滲透勢(shì)有關(guān)；在高鹽條件下（500和800mmol/L），該基因表達(dá)量有所下降，可能與Na+限制K+吸收機(jī)制相關(guān)，因此，HKT類蛋白對(duì)于鹽角草細(xì)胞內(nèi)離子平衡調(diào)節(jié)具有重要作用［18］。

綜上所述，鹽角草SeHKT1基因全長(zhǎng)的獲得及系統(tǒng)的表達(dá)分析有助于我們進(jìn)一步研究該基因在鹽生植物中調(diào)節(jié)離子平衡，維持細(xì)胞滲透壓，揭示真鹽生植物的耐鹽機(jī)制，利用基因工程手段將其運(yùn)用于培育新的耐鹽品種具有一定的意義［19］。

4 結(jié)論

真鹽生植物鹽角草SeHKT1基因氨基酸序列中具有一個(gè)信號(hào)肽序列（1-35 aa），一個(gè)TrKH家族特征序列；該基因編碼的蛋白具有跨膜載體蛋白活性，共10個(gè)跨膜域，N端、C端及中部多個(gè)跨膜區(qū)呈現(xiàn)明顯的疏水性，符合載體類蛋白特點(diǎn)，因此推測(cè)SeHKT1蛋白為跨膜運(yùn)輸?shù)鞍?。qRT-PCR分析表明SeHKT1基因主要在根部表達(dá)，其表達(dá)能夠響應(yīng)外界NaCl和鉀離子濃度變化，編碼蛋白可能參與Na+和K+的吸收和運(yùn)輸。

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