徐珍珍 倪萬潮 張香桂 郭琪 徐鵬 沈新蓮

YABBY基因家族屬于鋅指蛋白超家族（Zinc finger super-family）的亞家族，在調(diào)控植物葉和花器官發(fā)育過程中起著重要的作用，是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，與植物形態(tài)建成有關(guān)［1-4］。該基因家族有兩個保守的結(jié)構(gòu)域，位于N端的C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和位于C端的YABBY結(jié)構(gòu)域，又稱與HMG box相似的“螺旋-環(huán)-螺旋”結(jié)構(gòu)域［5-7］。

目前，在很多植物中都有YABBY基因家族的相關(guān)報道，在模式生物擬南芥中研究的較為清楚。擬南芥YABBY基因家族有6個成員：FIL（FILAMENTOUS FLOWER）、CRC（CRABSCLAW）、INO（INNER NO OUTER）（YABBY4）、YAB2（YABBY2）、YAB3（YABBY3）和 YAB5（YABBY5）［8-12］， 擬 南芥YABBY基因家族的6個成員在其側(cè)生器官發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的作用。FIL參與花器官和葉的發(fā)育［10，13］；CRO 和 INO 基因有一定的組織特異性，CRC參與蜜腺和心皮遠(yuǎn)軸端的發(fā)育，INO基因則在外部珠被的發(fā)育中起著重要的作用［11，14-16］；YAB2、YAB3和YAB5基因主要在擬南芥的營養(yǎng)組織中特異表達(dá)［3，17］。

棉花作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，其纖維是紡織工業(yè)重要的天然纖維來源。隨著基因組學(xué)和測序技術(shù)的發(fā)展，二倍體D組雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii L.）、A組亞洲棉石系亞1號（G. arboreum）以及陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1（G. hirsutum L. acc. TM-1）相繼完成了測序工作［18-22］，從而為全基因組范圍內(nèi)分析基因家族奠定了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。當(dāng)前關(guān)于棉花YABBY基因家族的研究，鮮有報道。本研究利用公布的陸地棉TM-1的基因組數(shù)據(jù)，對YABBY基因家族進(jìn)行全基因組掃描，并進(jìn)一步分析其亞細(xì)胞定位、染色體分布、基序、進(jìn)化關(guān)系和組織表達(dá)情況等，旨在為進(jìn)一步深入探索YABBY基因家族的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

兩份陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1（G. hirsutum L.）蛋白和CDS數(shù)據(jù)：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（http：//cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp）和 Pytozome 網(wǎng)站（http：//www.phytozome.net/）；擬南芥 YABBY 基因家族的氨基酸蛋白序列和陸地棉EST數(shù)據(jù)來自NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）數(shù)據(jù)庫；衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）YABBY基因家族的氨基酸序列來自PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 棉花YABBY基因家族的鑒定與進(jìn)化樹分析 將下載的擬南芥6條YABBY基因家族成員在SMART網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，然后在Pfam（http：//pfam.janelia.org/）網(wǎng)站下載鑒定到的YABBY結(jié)構(gòu)域的種子文件（PF04690.9），最終利用HMMER3.1b1程序在TM-1蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索棉花YABBY基因家族成員。

利用MEGA 5.1生物信息軟件對鑒定的TM-1基因組中YABBY基因家族氨基酸序列和擬南芥中6條YABBY基因家族的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，采用鄰接（Neighbor-Joining，NJ）算法構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行1000次Boot strap抽樣。

1.2.2 棉花YABBY基因家族的染色體定位和亞細(xì)胞定位 結(jié)合Perl語言編程，在TM-1基因組數(shù)據(jù)中的gff3文件中提取YABBY基因家族成員的染色體起始和結(jié)束位置，然后利用MapInspect軟件繪制YABBY基因家族的染色體物理分布圖；利用在線軟件 CELLO：Subcellular Localization Predictive System預(yù)測棉花YABBY基因家族成員的亞細(xì)胞定位。

1.2.3 棉花YABBY基因家族的基序分析 利用MEME軟件分析棉花YABBY基因家族成員的motif類型和排列順序。參數(shù)設(shè)置如下：基序的最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目是10個，其它參數(shù)為默認(rèn)值。

1.2.4 棉花的YABBY基因家族的組織表達(dá)分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫下載330 520條陸地棉的EST序列。利用Blastn程序，搜索棉花YABBY基因家族成員CDS序列與陸地棉EST序列的匹配，分析棉花YABBY基因家族成員的組織表達(dá)類型，參數(shù)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為E≤10-10，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

2 結(jié)果

2.1 棉花YABBY基因家族的鑒定

通過結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)擬南芥的6條YABBY蛋白的氨基酸序列都含有YABBY結(jié)構(gòu)域。因此，利用Pfam網(wǎng)站中下載的YABBY結(jié)構(gòu)域的種子文件在陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索，又在SMART網(wǎng)站進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)和人工校對，最終在TM-1基因組中鑒定到23條YABBY蛋白。根據(jù)一般植物蛋白的命名方法，對鑒定到的23條棉花YABBY蛋白進(jìn)行了命名，并統(tǒng)計了它們對應(yīng)的蛋白ID號、所在的亞基因組以及對應(yīng)的蛋白長度，從159個氨基酸到220個氨基酸不等（表1）。

2.2 棉花YABBY基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

我們以衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）作為外類群，利用陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組中鑒定的23條YABBY蛋白和擬南芥的6條YABBY蛋白的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。與擬南芥類似，棉花的YABBY基因家族也分為4個亞組（Ⅰ-Ⅳ），且每個亞組都有與擬南芥同源的基因：GhYABBY15、GhYABBY5、GhYABBY17、GhYABBY6、GhYABBY8、GhYABBY19、GhYABBY4、GhYABBY16、GhYABBY1和GhYABBY23屬于Ⅲ亞組，與擬南芥AtYABBY5屬于一個亞組；GhYABBY10、GhYABBY18和GhYABBY7屬于亞組Ⅳ，與擬南芥AtYABBY2屬于一個亞組；GhYABBY22、GhYABBY12、GhYABBY9、GhYABBY20、GhYABBY11和 GhYABBY21屬于亞組Ⅰ，與擬南芥FIL和AtYABBBY3屬于一個亞組；GhYABBY3、GhYABBY14、GhYABBY13和 GhYABBY2屬于亞組Ⅱ，與擬南芥CRC和AtYABBY4屬于一個亞組。

表1 陸地棉TM-1全基因組YABBY基因家族的基本信息

圖1 陸地棉TM-1和擬南芥YABBY基因家族的進(jìn)化樹

2.3 棉花YABBY基因家族的染色體定位和亞細(xì)胞定位

陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組中23個YABBY基因家族成員分布在16條染色體和1條Scaffold上，分 別 為 A01、D01、D02、A03、A04、A05、D05、A06、D06、A07、D07、A09、A11、D11、A12、D12和 Scaffold3715_D01（圖 2）；除了 A07和 D07染色體上分別有3個成員外，其他染色體上只有1-2個成員（圖2）；在TM-1的A亞組和D亞組具有成對的平行進(jìn)化同源YABBY基因，分布在D01、A01、Scaffold3715_D01、A05、D05、A07、D07、A11、D11、A12和D12染色體上；共有9對共線性基因，分別為GhYABBY13和GhYABBY2、GhYABBY1和 GhYABBY23、GhYABBY5和 GhYABBY15、GhYABBY6和 GhYABBY17、GhYABBY7和GhYABBY18、GhYABBY8和 GhYABBY19、GhYABBY9和 GhYABBY20、GhYABBY11和 GhYABBY21、GhYABBY12和 GhYABBY22。

圖2 陸地棉TM-1基因組上YABBY基因家族的染色體分布

TM-1基因組中23個YABBY基因家族成員的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果（表1）表明，13個YABBY基因家族成員具有1個亞細(xì)胞定位，定位到細(xì)胞核或胞外；8個成員具有2個亞細(xì)胞定位，定位到細(xì)胞核和胞外；2個成員具有3個亞細(xì)胞定位，定位到細(xì)胞核、胞外和線粒體上。

2.4 棉花YABBY基因家族的基序（motif）分析

棉花的YABBY基因組家族分為4個亞組（Ⅰ-Ⅳ），23個YABBY基因家族成員的基序分析結(jié)果顯示，每個亞組的成員具有相同或類似的基序類型和排列順序，而且9對同線性基因具有相同的基序類型和排列順序（圖3）。GhYABBY15、GhYABBY5、GhYABBY17、GhYABBY6、GhYABBY8、GhYABBY19、GhYABBY4、GhYABBY16、GhYABBY1和GhYABBY23具有相似的motifs（7-8個），motif排列順序也基本相同；GhYABBY18、GhYABBY10和GhYABBY7具有類似的motifs（4-6個），排序順序 也 類 似 ；GhYABBY22、GhYABBY12、GhYABBY9、GhYABBY20、GhYABBY11和 GhYABBY21具有完全相同的6個motifs，而且排列順序完全相同；GhYABBY3、GhYABBY14、GhYABBY13和 GhYABBY2具有相似的4-5個motifs，排序順序類似。

圖3 陸地棉TM-1基因組上YABBY基因家族的基序類型

2.5 棉花YABBY基因家族的組織表達(dá)分析

TM-1全基因組中的23個YABBY基因家族成員在棉花的根、莖、葉、花、蕾、幼胚珠、胚珠、纖維、莖端分生組織、分生區(qū)和胚性愈傷組織中廣泛表達(dá)（表2）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所有的23個YABBY基因家族成員在2個及兩個以上的組織中表達(dá)；23個YABBY基因家族成員全部在花、蕾和莖端分生組織中表達(dá)，大部分成員在根、莖和分生區(qū)域表達(dá)，還有部分基因在胚珠和胚性愈傷組織表達(dá)。

3 討論

本研究通過生物信息學(xué)和基因組學(xué)手段在陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1全基因組中共鑒定了23條YABBY基因家族成員，其中有9對為共線性基因（A亞組和D亞組），只有5個基因不是共線性基因，這與以往的報道一致，二倍體A組亞洲棉和D組雷蒙德氏棉基因組之間存在很強(qiáng)的共線性［22］；9對共線性基因中，除了GhYABBY9和GhYABBY20、GhYABBY13和GhYABBY2以外，其余7對共線性基因的氨基酸長度完全相同；除了GhYABBY13和GhYABBY2這一對共線性基因外，其余的每對共線性基因具有完全相同的亞細(xì)胞定位；9對共線性基因在進(jìn)化上非常保守，在進(jìn)化樹上分布在相同的分支上；motif分析表明，除GhYABBY13和GhYABBY2外，其余的每對共線性基因具有完全相同的motif類型和排列順序。

擬南芥YABBY基因家族有6個成員FIL、CRC、AtYABBY4、AtYABBY2、AtYABBY3 和 AtYABBY5，其中每個成員的功能都已研究得較為清楚［8-12］。進(jìn)化樹分析表明，本研究在陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組中鑒定的23個YABBY基因家族成員與擬南芥一樣，分為4個亞組，且每一個亞組都有與擬南芥同源的基因，由此推測，棉花和擬南芥YABBY基因家族成員在功能上可能具有一定的相似性。因此，研究棉花YABBY基因家族成員的功能，在一定程度上可以參考擬南芥的研究結(jié)果。

表2 陸地棉TM-1全基因組YABBY基因家族的組織表達(dá)模式

組織表達(dá)分析（表2）表明，TM-1全基因組中的23個YABBY基因家族成員具有較為廣泛的組織表達(dá)類型。其中，23個YABBY基因家族成員全部在花、蕾和莖端分生組織中表達(dá)，這在一定程度上暗示棉花的YABBY基因家族成員可能參與了花、蕾和莖端分生組織的發(fā)育；亞組Ⅰ的6個成員和亞組Ⅲ的部分成員都在根、莖和分生區(qū)域表達(dá)，這在一定程度上暗示這些基因可能參與了根、莖和分生區(qū)域的發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究從陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1（Gossypium hirsutum L. acc. TM-1）基因組中鑒定到23個YABBY基因家族成員，具有不同的亞細(xì)胞定位和染色體定位，且具有較為廣泛的組織表達(dá)類型。這些成員分為4個亞組，每個亞組成員間具有相似的基序類型和排列順序。

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