姜廣宇 董 航 廉曉宇 李 闖 (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

癲癇是一種常見(jiàn)的慢性腦部疾病，多數(shù)患者需要長(zhǎng)期或終身服用抗癲癇藥物〔1〕。癲癇的機(jī)制尚不完全清楚。近年的研究表明，c-fos、c-jun在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)和調(diào)控與癲癇的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在引起神經(jīng)元功能改變特別是在遠(yuǎn)期效應(yīng)方面具有重要作用〔2〕。托吡酯(TPM)是安全有效的抗癲癇藥物，廣泛應(yīng)用于癲癇的治療。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用海人酸制備大鼠癲癇模型，分別給予不同劑量的TPM，應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)大鼠腦組織cfos、c-jun的表達(dá)，為臨床癲癇的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 TPM:西安楊森制藥有限公司，海人酸:美國(guó)Sigma公司。c-fos、c-jun多克隆抗體及SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中山生物科技有限公司。地西泮注射液:吉林通化茂祥制藥有限公司。Wistar雄性大鼠40只，體重250～300 g，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 癲癇模型制備及分組 健康雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為四組，每組10只。正常組不給予任何處理。另30只大鼠制備成慢性癲癇模型:腹腔注射海人酸(10 mg/kg)，2 d 1次，發(fā)作2 h后按每公斤體重腹腔注射10 mg地西泮終止癲癇發(fā)作。給藥后觀察30 min，凡連續(xù)5次出現(xiàn)2級(jí)以上且持續(xù)2 h以上發(fā)作即判定該大鼠被慢性點(diǎn)燃。此后海人酸腹腔注射改為每4天1次，以維持點(diǎn)燃效應(yīng)。模型成功后分為模型組，TPM、高劑量組。模型組給予生理鹽水2 ml/kg體重，TPM低、高劑量組分別給予TPM 20 mg/kg與50 mg/kg，腹腔注射，持續(xù)給藥4 w。

1.3 腦組織取材 采用灌流腦組織取材方法，將大鼠以10%水合氯醛麻醉，開(kāi)胸，經(jīng)升主動(dòng)脈快速推注250 ml生理鹽水灌洗液，繼而注射4%多聚甲醛灌注液200 ml，立即取腦并取出雙側(cè)海馬組織，置入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，用于免疫組化染色。

1.4 免疫組化法檢測(cè)海馬腦組織c-fos和c-jun的表達(dá) 腦組織切片按SP免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)海馬腦組織中c-fos和c-jun的蛋白表達(dá)，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。結(jié)果圖像采集應(yīng)用Leica Application suite軟件，圖像處理應(yīng)用Leica Qwin軟件(德國(guó)萊卡公司)，每張切片取5個(gè)400倍視野，測(cè)定每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行q檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

免疫組化染色后顯示，海馬腦組織c-fos、c-jun表達(dá)在正常對(duì)照組偶見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，且著色較淡，部位不定。模型組海馬區(qū)可見(jiàn)c-fos、c-jun明顯增強(qiáng)，棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，細(xì)胞著色較深。TPM組c-fos、c-jun表達(dá)比模型組明顯減弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 癲癇大鼠海馬腦組織c-fos、c-jun的表達(dá)(SP，×400)

表1 大鼠海馬區(qū)腦組織c-fos、c-jun免疫陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)(±s，n=10)

表1 大鼠海馬區(qū)腦組織c-fos、c-jun免疫陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)(±s，n=10)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

分組 劑量(mg/kg)c-fos c-jun正常組模型組低劑量組高劑量組--20 503.46±1.0322.35±4.611)14.57±5.322)12.62±3.582)5.26±1.0412.48±2.321)9.42±2.366.76±3.242)

3 討論

在各種藥物刺激、針刺或電刺激等誘發(fā)的癲癇、驚厥發(fā)作時(shí)，“即早基因”出現(xiàn)明顯反應(yīng)，其中對(duì)c-fos和c-jun研究較多。癲癇可誘導(dǎo)腦內(nèi)c-fos基因表達(dá)，并且c-fos表達(dá)的差異與癲癇發(fā)作的強(qiáng)度和致癇劑有關(guān)，c-fos表達(dá)可以涉及雙側(cè)海馬、皮質(zhì)和杏仁體〔3〕。c-fos在胞質(zhì)形成后迅速入核，與c-jun表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)亮氨酸拉鏈形成同源或異源二聚體復(fù)合物，結(jié)合至靶基因啟動(dòng)子AP-1位點(diǎn)，調(diào)節(jié)后期反應(yīng)基因(LRG)的表達(dá)，LRG的表達(dá)產(chǎn)物改變了神經(jīng)元的固有成分以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮性，如減少γ-氨基丁酸釋放，促進(jìn)谷氨酸釋放等，破壞了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的興奮抑制平衡，最終在特定部位形成異常癲癇灶〔4〕。c-jun調(diào)控范圍十分廣泛，能特異性地在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)。腦低氧、缺血可誘導(dǎo)c-jun在相應(yīng)缺血缺氧部位的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。癲癇發(fā)作時(shí)，c-fos或c-jun的變化能代表神經(jīng)元的興奮狀態(tài)，在突觸的可塑性和神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用〔5，6〕，通過(guò)定性分析或定量分析其蛋白表達(dá)水平的高低，從而來(lái)判斷某種抗癲癇藥物在治療或致癇中的作用大小。

TPM為應(yīng)用廣泛的廣譜抗癲癇藥，臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都表明具有多種抗癲癇機(jī)制，對(duì)不同類(lèi)型的癲癇發(fā)作均具有獨(dú)特的療效，與其他抗癲癇藥物比較療效更好、毒副作用更小而被廣泛應(yīng)用于癲癇病的治療〔7〕。本研究提示TPM的抗癲癇作用機(jī)制與調(diào)控c-fos或c-jun的表達(dá)有關(guān)，可能是TPM通過(guò)減少c-fos或c-jun的表達(dá)，從而減低了轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性，抑制后期反應(yīng)基因活化，使神經(jīng)細(xì)胞減少異常放電，減弱了癲癇發(fā)作的強(qiáng)度;也可能是c-fos或c-jun的減弱表達(dá)與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的缺血缺氧狀態(tài)或抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。關(guān)于TPM詳細(xì)的抗癲癇機(jī)制還有待于后續(xù)研究。

1 周家帆，楊 輝.左乙拉西坦用于中老年部分性發(fā)作癲癇患者的療效〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014;34(6):1621-2.

2 張林挺，艾 華.栝樓桂枝湯對(duì)戊四氮點(diǎn)燃癲癇大鼠大腦內(nèi)c-fos和c-jun水平影響的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.四川中醫(yī)，2005;23(8):21-2.

3 孫春英，臧穎卓.托吡酯對(duì)戊四氮點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠海馬Fas表達(dá)的影響〔J〕.疑難病雜志，2008;7(11):654-6.

4 王國(guó)才，馮鐵為，李敬孝.抗癇靈對(duì)戊四氮致癇大鼠腦組織中海馬區(qū)c-fos蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2012;40(6):20-1.

5 Choi WJ.The Heterochromatin-1 phosphorylation contributes to TPA-Induced AP-1 expression〔J〕.Biomol Ther，2014;22(4):308-13.

6 陳陽(yáng)美，曾可斌，謝運(yùn)蘭.等.青陽(yáng)參對(duì)點(diǎn)燃癲癇大鼠腦內(nèi)c-fos、cjun基因表達(dá)的影響〔J〕.中藥藥理與臨床，2003;19(5):26-7.

7 Beghi E.Efficacy and tolerability of the new antiepileptic drugs:comparis on of two recent guidelines〔J〕.Lancet Neurol，2004;3(10):618-21.