詹光杰 楊年安(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

富硒板黨(BCPA)因出產(chǎn)于有“中國硒都”之稱的湖北恩施板橋境內(nèi)而得名。1981年在全國藥材品種質(zhì)量鑒定會(huì)上定名為“中國板黨”，簡稱“板黨”。BCPA富含多種甾醇、多糖、皂甙、多種氨基酸和微量元素，有清除體內(nèi)活性氧，減少丙二醛(MDA)產(chǎn)生，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力等藥理作用〔1，2〕。本研究采用D-半乳糖誘導(dǎo)致亞急性衰老小鼠模型，分別注射不同劑量BCPA注射液，觀察BCPA對(duì)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，并從氧化應(yīng)激方面探討B(tài)CPA抗衰老作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠(雌雄各半)，5～7周齡，體重(22.3±3.2)g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 藥品與儀器 D-半乳糖(Sigma公司)，IL-2、IL-6 ELISA試劑盒(晶美公司)，MDA、LP、GSH-Px、SOD 及羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物制品研究所)，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?湖北恩施樂之塬科技公司)。FA1640電子天平(上海天平儀器廠)，電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝科技股份有限公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國 Thermo公司)，紫外分光光度儀(美國Beckman公司)，DMS-2 Morris水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。

1.3 BCPA注射液 購自恩施板橋鄉(xiāng)中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)示范基地，采用水提醇沉法制成含生藥30%(相當(dāng)于生藥含量2 g/ml)的液體，瓶裝密封消毒貯存于4℃?zhèn)溆?，用時(shí)以生理鹽水稀釋成0.4 g/ml。

1.4 動(dòng)物分組、造模及給藥 將昆明種小鼠(雌雄各半)40只，隨機(jī)分為正常組、模型組、高劑量組、中劑量組及低劑量組，每組8只。模型組、高劑量組、中劑量組及低劑量組每天按500 mg/kg腹腔注射D-半乳糖〔3〕，正常組腹腔注射相等量生理鹽水。高劑量組、中劑量組及低劑量組在注射D-半乳糖的同時(shí)每天腹腔按7.2、3.6及1.8 g/kg注射BCPA，模型組、正常組注射等量生理鹽水。各組自由進(jìn)食、飲水，常規(guī)飼養(yǎng)連續(xù)50 d。

1.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 從造模給藥第40天起，參照Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法測量小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力〔4，5〕。每天注射后進(jìn)行訓(xùn)練，上下午各1次，歷時(shí)10 d。水迷宮為通用型，圓形桶，直徑180 cm、高50 cm，水池內(nèi)壁涂為黑色，水深30 cm，水溫控制在22℃ ～24℃。在水池壁邊沿平均分為四個(gè)不同的標(biāo)記，把水池分為一、二、三、四個(gè)象限，選第三象限正中放置高度為28 cm，直徑8 cm的平臺(tái)，沒入水下2 cm。將小鼠面向池壁，依次由第一、二、三、四象限入水點(diǎn)放入水中，記錄120 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)，如120 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引至上面停留10 s，再放回籠中，逃避潛伏期記為120 s。第9天最后1次訓(xùn)練后撤除水下平臺(tái)，第10天在同一入水點(diǎn)將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠在120 s內(nèi)跨越原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)，以衡量小鼠對(duì)水迷宮記憶的獲取能力。

1.6 小鼠皮膚羥脯氨酸及腦組織MDA、脂褐質(zhì)(LP)、SOD及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的檢測 水迷宮訓(xùn)練結(jié)束后，分別取各組小鼠背部皮膚約1 cm2，去毛及脂肪，用1∶1丙酮-乙醚脫脂，切碎晾干，精密稱取30 mg，按試劑盒說明書進(jìn)行羥脯氨酸含量的測定。然后處死小鼠，取小鼠腦組織放入冰凍生理鹽水(0.9%)沖洗拭干，迅速用精密分析天平稱取重量后剪碎，制備成10%勻漿，離心后取上清。按照試劑盒說明書分別進(jìn)行組織MDA、LP、SOD及GSH-Px的檢測，并用紫外分光光度計(jì)測定出結(jié)果。

1.7 ELISA法檢測BCPA對(duì)小鼠血清中白細(xì)胞介素(IL)-2及IL-6的影響 小心收集小鼠血清于無內(nèi)毒素、熱原的試管中，及時(shí)處理或貯存在－70℃冰箱。檢測采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法，具體步驟參考試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 BCPA對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠定位航行和空間探索的影響 模型組小鼠找到平臺(tái)的潛伏期長。BCPA各組潛伏期與模型組相比較均有明顯減少(P＜0.05)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)比其他各組小鼠的次數(shù)少(P＜0.05)。見表1。

2.2 BCPA對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織勻漿的抗氧化作用 對(duì)照組及BCPA各組組織勻漿MDA與LP含量均低于模型組(P＜0.05)。對(duì)照組及BCPA各組組織勻漿中SOD與GSH-Px的活性明顯高于模型組(P＜0.05)。高劑量與低劑量BCPA組的MDA與LP含量要低于低劑量BCPA組，而其SOD與GSH-Px活性高于低劑量BCPA組(P＜0.05)。見表2。

2.4 BCPA對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠皮膚羥脯氨酸含量的影響 模型組、BCPA低、中、高劑量組小鼠皮膚羥脯氨酸含量分別為(7.48±2.67)、(9.83±1.34)、(10.27±1.52)、(11.54±2.35)μg/ml，注射D-半乳糖各組小鼠皮膚羥脯氨酸含量都明顯低于對(duì)照組〔(14.32±2.85)μg/ml，P ＜0.05〕，然而 BCPA 各組小鼠皮膚中羥脯氨酸的含量明顯高于模型組(P＜0.05)。

2.3 BCPA對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠各組血清中IL-2、IL-6含量的影響 見表2。各BCPA組小鼠血清中IL-2、IL-6含量顯著高于對(duì)照組和模型組(P＜0.05)，模型組小鼠血清中IL-2、IL-6比對(duì)照組要低(P＜0.05)。

表1 BCPA對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠定位航行和空間探索的影響(±s，n=8)

表1 BCPA對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠定位航行和空間探索的影響(±s，n=8)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別 平均潛伏期(s) 穿越原平臺(tái)次數(shù)(次)BCPA低劑量組 54.65±11.1211) 3.87±1.2411)BCPA中劑量組 52.32±10.4511) 4.12±1.4311)BCPA高劑量組 50.12±9.8711) 4.36±1.0811)模型組 81.27±20.341.24±0.65對(duì)照組 46.76±11.351) 4.58±1.531)

表2 BCPA對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織勻漿的抗氧化性作用及對(duì)小鼠血清IL-2、IL-6含量的影響(±s，n=8)

表2 BCPA對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織勻漿的抗氧化性作用及對(duì)小鼠血清IL-2、IL-6含量的影響(±s，n=8)

與模型組比較:1)P＜0.05，與BCPA低劑量組比較:2)P＜0.05

組別SOD(U/mg)MDA(mol/mg)LP(μg/mg)GSH-Px(U/g)IL-2(pg/ml)IL-6(ng/L)BCPA低劑量組 155.36±10.4211) 9.36±0.5211) 65.42±1.8811) 67.31±1.6511) 90.13±4.091) 123.16±3.671)BCPA中劑量組 187.34±8.3121)2) 8.57±0.9121)2) 58.51±1.3421)2) 70.35±3.1821)2) 105.34±4.251) 142.08±3.531)2)BCPA高劑量組 195.21±9.1421)2) 7.24±0.8421)2) 51.57±1.5821)2) 75.42±2.8321)2) 118.65±4.571)2) 164.23±3.451)2)模型組 121.47±9.7613.67±1.5677.32±1.7655.13±3.2532.78±2.952) 53.87±2.742)對(duì)照組 184.28±7.5811) 9.04±0.4511) 57.62±2.4511) 64.57±4.4711) 57.82±3.241)2) 96.54±3.081)2)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)是采用連續(xù)注射D-半乳糖在小鼠體內(nèi)積累，使細(xì)胞內(nèi)醛糖還原酶將其還原成不能正常代謝的半乳糖醇，而半乳糖醇一旦在體內(nèi)堆積就會(huì)影響細(xì)胞的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、細(xì)胞功能障礙、代謝紊亂而致使機(jī)體衰老〔6〕。衰老是一種復(fù)雜的生命現(xiàn)象，機(jī)體在發(fā)育成熟后，體內(nèi)各種生理功能進(jìn)行性下降的過程。有關(guān)衰老的機(jī)制，科學(xué)家提出了多種假說，自由基學(xué)說就是其中之一。該學(xué)說主要觀點(diǎn)認(rèn)為衰老是生命過程中代謝所產(chǎn)生的活性氧造成的損傷累積而引起的，抗氧化轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了這一理論，過量表達(dá)SOD和過氧化氫酶的轉(zhuǎn)基因果蠅壽命得以延長〔7〕。過多的氧自由基會(huì)造成細(xì)胞膜的破壞，使蛋白質(zhì)(酶)變性，并會(huì)導(dǎo)致一系列神經(jīng)功能損傷，造成認(rèn)知障礙，加速衰老。

衰老早期的認(rèn)知受損主要表現(xiàn)在學(xué)習(xí)能力的下降及記憶障礙。本研究結(jié)果提示小鼠的空間定位能力、空間記憶能力等認(rèn)知能力均出現(xiàn)了一定程度的損傷，BCPA對(duì)衰老過程中的認(rèn)知障礙有較好的恢復(fù)作用。SOD在有機(jī)體內(nèi)平衡氧化與抗氧化，清除超氧離子自由基，保護(hù)細(xì)胞;MDA則是通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，破壞生物膜中的不飽合脂肪酸，形成脂質(zhì)過氧化物，導(dǎo)致細(xì)胞損傷;LP在細(xì)胞中的堆積會(huì)引起細(xì)胞免疫能力的下降，細(xì)胞功能受損，誘發(fā)衰老，如果在腦細(xì)胞中堆積則會(huì)引發(fā)學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)識(shí)障礙;GSH-Px可特異性還原GSH對(duì)過氧化氫的還原，清除有害過氧化物代謝產(chǎn)物，切斷脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞正常生理功能。本實(shí)驗(yàn)提示不同劑量BCPA對(duì)D-半乳糖所致衰老模型小鼠的作用效果是不同的，本研究推測與BCPA注液中有效成分的含量有關(guān)。

羥脯氨酸本是膠原蛋白的組成成分，在機(jī)體衰老過程中，會(huì)因氧氣供給不足而影響脯氨酸的羥化作用，致使皮膚中羥脯氨酸的含量下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BCPA可以有效地恢復(fù)衰老小鼠皮膚中的羥脯氨酸的含量。

IL-2可維持細(xì)胞的增殖，刺激T細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體等抗原表達(dá)，誘導(dǎo)多種殺傷細(xì)胞的分化和效應(yīng)功能。IL-6與IL-6受體結(jié)合后，在機(jī)體內(nèi)有多種生物學(xué)活性，如可影響細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞分化等。在本實(shí)驗(yàn)中BCPA能顯著增加小鼠體內(nèi)的IL-2和IL-6的含量，提示BCPA能有效地增強(qiáng)衰老小鼠的免疫功能，有助于促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖。

本研究結(jié)果表明BCPA的有效成分具有多種生物學(xué)活性，可以通過不同的通路發(fā)揮抗衰老作用，在改善學(xué)習(xí)記憶功能，清除體內(nèi)自由基抗氧化，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等方面都有較好的作用，但BCPA抗衰老機(jī)制還有待于從分子水平進(jìn)行研究。

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2 郭 美，劉麗莎，何 敏，等.黨參抗衰老作用的研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013;33(5):1205-7.

3 姜國良，于 曉，徐 愷，等.腹腔和皮下注射D-半乳糖衰老大鼠模型分析〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013;33(5):1101-3.

4 王緒平，咼登俊，陳 宇，等.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)血管性癡呆大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013;31(1):99-100.

5 劉金鳳，聶 坤，栗振杰，等.Morris水迷宮測評(píng)方法的改進(jìn)及對(duì)快速老化癡呆小鼠SAMP8認(rèn)知功能的再評(píng)價(jià)〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2013;22(1):5-7.

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