康湘萍 梁 超 金國琴 張學(xué)禮 龔張斌 夏花英

(上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，上海 201203)

伴隨衰老，機(jī)體會(huì)出現(xiàn)一系列生理功能下降或紊亂的表現(xiàn)，尤其是腦結(jié)構(gòu)和功能的改變，后者會(huì)直接導(dǎo)致老年人認(rèn)知能力進(jìn)行性損害，影響老年人的活動(dòng)能力及生活質(zhì)量，給家庭、社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)〔1～3〕。中醫(yī)認(rèn)為腎乃先天之根，封藏之本;《靈樞·經(jīng)脈》云:“人之情與志，皆藏于腎”;故歷年來補(bǔ)腎益精填髓被中醫(yī)臨床用作改善學(xué)習(xí)記憶退化的重要治則。本研究以中醫(yī)衰老腎虛理論為指導(dǎo)，從sortilin腦源性神經(jīng)生長因子前體(proBDNF)-p75NTR介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡入手，進(jìn)一步探究老年學(xué)習(xí)記憶能力減退的分子機(jī)制，同時(shí)觀察經(jīng)典補(bǔ)腎方藥左歸丸及其君藥熟地黃對該途徑的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 左歸丸組成:熟地黃20 g、山藥10 g、菟絲子10 g、枸杞子 10 g、山茱萸 10 g、牛膝 7.5 g、龜板膠 10 g、鹿角膠10 g，上述中藥均購自上海康橋中藥飲片有限公司，湯藥常規(guī)方法煎煮，最終濃縮為含生藥1 g/ml的煎液，-20℃保存;熟地黃水煎后過濾，濃縮為每1 ml藥液含2 g生藥的提取藥液，-20℃保存，臨用前飲用水稀釋后灌胃使用。

1.2 動(dòng)物造模及分組 雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重(250±30)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2009-0069。大鼠稱重后隨機(jī)分為五組:青年對照組、衰老模型組、衰老左歸組、衰老熟地大劑量組(簡稱衰老熟大組)及衰老熟地小劑量組(簡稱衰老熟小組)。除青年對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射D-半乳糖生理鹽水500 mg/kg，連續(xù)造模56 d〔4〕，青年對照組腹腔注射等量生理鹽水;衰老左歸組灌服左歸丸藥液，劑量相當(dāng)于臨床成人每kg體重劑量的7倍〔5〕，衰老熟大組灌服熟地黃藥液8 g/kg體重，衰老熟小組灌服熟地黃藥液4g/kg體重，青年對照組和衰老模型組灌服蒸餾水，每只大鼠的灌胃體積均為4 ml，連續(xù)56 d〔6〕。

1.3 試劑與儀器 D-半乳糖(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)(Pierce公司)、PVDF膜(Milipore公司)、proBDNF抗體、sortilin抗體(Abcam公司)，p75NTR抗體、caspase-3抗體、bcl-2抗體、bax抗體、GAPDH抗體(Cell Signaling公司)，超薄切片機(jī)(Leica Ultracut R)，透射電鏡(型號(hào):Philips Tecnai-12 Biotwin)，蛋白電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)移槽(Bio-Rad公司)及凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Protein Simple公司，F(xiàn)CM型)。

1.4 空間學(xué)習(xí)記憶能力測試 采用Morris水迷宮法，平臺(tái)設(shè)于迷宮西南象限正中，水面高出平臺(tái)1.5 cm，水溫19℃ ～20℃，大鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d，2次/d，分別從正北、正東兩個(gè)起始點(diǎn)投放，設(shè)定最長游動(dòng)時(shí)限為70 s，電腦自動(dòng)計(jì)時(shí)，記錄大鼠找到平臺(tái)所需要的時(shí)間，即潛伏期。如大鼠70 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，潛伏期計(jì)為70 s。記錄各組大鼠每天兩次潛伏期(s)，取均值。

1.5 透射電鏡觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 海馬組織分離后切成1 mm×1 mm×3 mm的長條小塊，2.5%戊二醛固定，pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，再用1%鋨酸固定，梯度酒精、丙酮脫水，618樹脂浸透包埋，超薄切片機(jī)切片，3%醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察、拍片。

1.6 Western印跡法檢測海馬組織proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達(dá) 分別提取各組大鼠海馬蛋白，雙縮脲法定量蛋白并根據(jù)測定結(jié)果稀釋處理蛋白。SDSPAGE電泳，上樣量為40 μg蛋白/孔，電泳結(jié)束后，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min，然后37℃、5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜(所有一抗的稀釋比例均參照抗體說明書)。次日，0.1 mmol/L PBST(pH7.4)洗膜后加入二抗(1∶10000 倍稀釋)，37℃孵育45 min，PBST洗膜后ECL顯色檢測結(jié)果，并求積分密度值(IOD)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析〔7〕。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮檢測各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力 隨著訓(xùn)練天數(shù)增加，各組大鼠潛伏期(s)呈逐漸縮短趨勢。從訓(xùn)練的第4天起，衰老模型組潛伏期較青年對照組明顯延長(P＜0.05)，衰老熟大組較衰老模型組潛伏期顯著縮短(P＜0.05);從游泳的軌跡上看，青年大鼠多以直線式和趨向式為主，而衰老模型大鼠多以邊緣式為主，見表1，圖1。

2.2 電鏡檢測各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 青年對照組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)及染色質(zhì)正常，核較小，可見線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng);衰老模型組大鼠海馬神經(jīng)元體積較小，著色深，周邊線粒體可見明顯腫脹，核仁完整，核仁有固縮現(xiàn)象;衰老左歸組、衰老熟大組及衰老熟小組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞體積略有縮小，細(xì)胞形態(tài)較完整，周邊線粒體略有腫脹，核仁完整，略有固縮，見圖2。

表1 左歸丸及熟地對各組大鼠潛伏期的影響(±s，n=10，s)

表1 左歸丸及熟地對各組大鼠潛伏期的影響(±s，n=10，s)

與青年對照組比較:1)P＜0.05;與衰老模型組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天青年對照組 63.9±4.157.3±5.3855.6±6.139.8±3.725.4±2.2衰老模型組 70.0±0.066.9±3.163.6±3.361.1±3.71)54.8±3.91)衰老左歸組 63.1±4.764.0±4.463.8±3.156.0±3.747.1±4.4衰老熟大組 67.1±2.967.8±1.564.6±3.659.3±3.851.6±4.6衰老熟小組 68.7±1.366.0±2.258.3±5.343.5±3.02)34.1±2.32)

圖1 各組大鼠典型運(yùn)動(dòng)軌跡圖

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

2.3 Western印跡法檢測海馬組織proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達(dá) 如表2、圖3所示，與青年對照組比較，衰老模型大鼠海馬proBDNF、caspase-3、bax表達(dá)明顯升高，bcl-2表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，p75NTR和sortilin表達(dá)有升高的趨勢;與衰老模型組比較，左歸丸、熟地均能不同程度地降低衰老模型大鼠海馬proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3及bax蛋白表達(dá)，提高bcl-2蛋白表達(dá)。

表2 左歸丸及熟地對各組大鼠proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達(dá)的影響(±s，n=7)

表2 左歸丸及熟地對各組大鼠proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2及bax蛋白表達(dá)的影響(±s，n=7)

proBDNF p75NTR sortilin caspase-3 bcl-2 bax青年對照組 0.393±0.0360.353±0.0650.388±0.0490.121±組別0.0280.638±0.0420.319±0.049衰老模型組 0.676±0.0481) 0.571±0.0970.747±0.0900.700±0.0491) 0.169±0.0301) 0.727±0.0531)衰老左歸組 0.520±0.0282) 0.502±0.0760.645±0.0930.349±0.0602) 0.390±0.0412) 0.520±0.0542)衰老熟大組 0.493±0.0492) 0.468±0.0830.605±0.0810.362±0.0602) 0.318±0.0362) 0.617±0.047衰老熟小組 0.448±0.0452) 0.462±0.0790.578±0.0590.257±0.0202) 0.370±0.0452) 0.495±0.0462)

圖3 各組大鼠海馬proBNP、p75NTR、sortilin、caspase-3、bcl-2、bax 蛋白表達(dá)

3 討論

D-半乳糖致衰老是根據(jù)衰老的代謝學(xué)說建立起來的造模方法，具有造模時(shí)間短、操作簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可表現(xiàn)出和自然衰老大鼠相似的衰老體征〔8〕，尤其是學(xué)習(xí)和記憶保持能力的降低〔9〕。

BDNF屬于神經(jīng)營養(yǎng)素(NT)蛋白家族中的一員，是神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的重要營養(yǎng)因子，被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶過程中的關(guān)鍵蛋白之一〔10，11〕。與其他神經(jīng)營養(yǎng)因子一樣，BDNF由其前體物質(zhì)proBDNF裂解而成。在很長一段時(shí)間內(nèi)，proBDNF被認(rèn)為只是單純的蛋白前體分子而不具有生物學(xué)活性，直到1997年，Dicou等〔12〕首次報(bào)道proBDNF與成熟的BDNF同樣具有生物學(xué)活性;后續(xù)大量研究也證實(shí)〔13，14〕，proBDNF 可能有著和BDNF相反的生物學(xué)功能，能夠降低老齡大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。神經(jīng)營養(yǎng)素有兩種受體即低親和力受體p75NTR和高親和力受體Trk，BDNF通過其高親和力受體TrkB的介導(dǎo)作用，最終可以影響海馬神經(jīng)元突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶功能，在LTP的形成中具有非常重要的作用〔15〕;而proBDNF則與p75NTR以高親和力結(jié)合，激活p75NTR介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且這種結(jié)合需要有一種特定的膜蛋白，這種膜蛋白就是sortilin，它是一個(gè)相對分子量為95 kD的Ⅰ型膜糖蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉中廣泛表達(dá)。研究表明〔14，16〕，sortilin是與 proBDNF 及 p75NTR 結(jié)合形成三聚體從而啟動(dòng)caspase依賴性神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)元退行性疾病的發(fā)生。

本研究結(jié)果提示sortilin-proBDNF-p75NTR啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致增齡性學(xué)習(xí)記憶能力減退的重要原因之一。

老年性學(xué)習(xí)記憶減退屬于中醫(yī)“健忘”的范疇，其病位在腦而本于腎，“腎虛、髓海不足”是學(xué)習(xí)記憶減退的主要病機(jī)，故治療當(dāng)以補(bǔ)腎填精益髓為主。左歸丸為明代張景岳所創(chuàng)，是補(bǔ)腎填精的名方，方中重用熟地黃滋腎益精，以填真陰，為君藥;有研究表明〔17〕，熟地黃能改善D-半乳糖致衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高腦組織的抗氧化能力，延緩腦細(xì)胞衰老的進(jìn)程。本研究的結(jié)果也表明，左歸丸與熟地黃能不同程度地改善神經(jīng)細(xì)胞凋亡，下調(diào)衰老大鼠海馬 proBDNF、p75NTR、sortilin、caspase-3及bax蛋白表達(dá)，上調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)，從而改善衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，延緩衰老。

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