黃益玲 胡火軍 尤程程 黃迎娣 黃利鳴 (三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，湖北 宜昌 443002)

天花粉蛋白(TCS)是一種單鏈核糖體失活蛋白，從葫蘆科植物栝蔞的塊根中提取出來。TCS早期主要用于引發(fā)中期流產(chǎn)，近年研究表明，TCS有多種生物學(xué)活性，能夠抑制人獲得性免疫缺陷病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)人體免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)〔1〕。關(guān)于TCS對(duì)人前列腺癌的抑制作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要研究TCS在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞(PC3細(xì)胞)的增殖抑制作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)于美國(guó)Amresco公司，碘化丙啶(PI)及RNA酶(RNase A)購(gòu)自Sigma公司，一抗ERK、p-ERK、Cyclin D1購(gòu)自 Cell Signal公司，β-actin、二抗 HRP 標(biāo)記的IgG抗體購(gòu)于Santa Cruz公司，TCS購(gòu)自上海金山制藥廠。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PCa PC3細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，培養(yǎng)于含10%的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的濕化孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT法測(cè)定TCS對(duì)PC3細(xì)胞的增殖抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC3細(xì)胞，以2×104個(gè)/ml的密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁 后 加 入 不 同 濃 度 的 TCS(0、20、40、60、80、100、120 μg/ml)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h 后每孔加入5g/L的 MTT溶液 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入200 μl DMSO溶解，測(cè)定570 nm處光吸收值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 離心收集經(jīng)TCS處理的PC3細(xì)胞，用含0.2%FBS的PBS清洗，加75%的冰冷乙醇固定，10000 r/min條件下離心5 min，去乙醇，以PBS洗滌兩次，棄上清。用0.5 ml PBS重懸細(xì)胞沉淀，加入等體積的細(xì)胞裂解緩沖液(1%NP-40，50 mmol/L Tris-HCl，40 mmol/L EDTA，pH 值7.5)室溫作用5～10 min，離心后加入終濃度為30 μg/ml的RNase于37℃水浴中消化 30 min，離心，10000 r/min離心5 min，加人1 ml終濃度為50 μg/ml的 PI避光染色 30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Multicycles軟件分析結(jié)果。

1.5 Western印跡檢測(cè) 離心收集經(jīng)不同濃度TCS處理的PC3細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液(注意臨用前加入各種蛋白酶抑制劑)提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，保證樣本中含有相同的蛋白含量，置95℃ ～100℃沸水中變性5 min，加入等體積2×SDS-PAGE加樣緩沖液行12.5%的SDS-PAGE垂直電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加50 g/L脂奶粉于室溫封閉1 h，PBST洗膜，分別加入一抗ERK、p-ERK、cyclin D1及β-actin于4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗滌3次，ECL反應(yīng)液A和B混合后加至膜上1 min，最后X片顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定TCS對(duì)PC3細(xì)胞增殖的抑制作用 1 d TCS對(duì)PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨其濃度的增大而加強(qiáng)，與未加藥物的對(duì)照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)。見表1。

表1 不同濃度TCS作用24、48、72 h對(duì)PC3細(xì)胞增殖的抑制作用(±s，n=3)

表1 不同濃度TCS作用24、48、72 h對(duì)PC3細(xì)胞增殖的抑制作用(±s，n=3)

與0 μg/ml組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

g/ml 0±1.520±3.520±2.3420 μg/ml 6.3±2.1314.53±3.451) 23.49±2.642)40 μg/ml 11.2±1.741) 25.96±3.772) 42.12±4.232)60 μg/ml 19.7±3.222) 47.62±2.062) 66.63±3.222)80 μg/ml 23.63±1.692) 52.81±3.132) 70.34±4.142)100 μg/ml 38.5±2.752) 72.78±4.252) 82.98±2.672)120 μg/ml 57.8±3.622) 79.23±2.762) 91.21±3.542)24 h 48 h 72 h 0 μ組別

2.2 TCS對(duì)PC3細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)20、40、80 μg/ml TCS作用24 h后PC3細(xì)胞周期情況，結(jié)果顯示，處于G1期的細(xì)胞比例分別為(37.4±0.45)%、(42.1±0.25)%、(59.9±0.09)%，與TCS未處理組(29.9±0.25)%相比差異顯著，表明TCS能引起PC3細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。

2.3 Western印跡檢測(cè)ERK、p-ERK、Cyclin D1表達(dá) 以β-actin為內(nèi)參，經(jīng) 20、40、80 μg/ml TCS 處理 PC3 細(xì)胞 24 h 后，p-ERK的表達(dá)受到抑制，且抑制作用隨藥物濃度的增加而加強(qiáng)，而Cyclin D1的表達(dá)呈明顯下降趨勢(shì)，見圖1。

圖1 TCS對(duì)P-ERK、ERK及Cyclin D1表達(dá)的影響

3 討論

部分前列腺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移〔2〕，晚期前列腺癌患者平均經(jīng)過2年的內(nèi)分泌治療后會(huì)進(jìn)展為激素難治性TCS(HRPC)〔3〕，化療是激素難治性前列腺癌的主要治療手段。

細(xì)胞過度增殖會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至腫瘤的形成。抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中某一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)從而阻斷異常活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是腫瘤治療的策略之一。絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞中，將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞增殖、分化、凋亡等一系列重要生化反應(yīng)〔4〕。ERK信號(hào)通路是 1993 年由 Her等〔5〕人發(fā)現(xiàn)的一條MAPK信號(hào)通路。ERK1/2亞功能區(qū)中的酪氨酸和蘇氨酸殘基可發(fā)生磷酸化激活，激活的ERK1/2由胞質(zhì)移位至細(xì)胞核后磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子〔6〕，調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化過程。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)中的重要過程，其關(guān)鍵是G1期的啟動(dòng)。Cyclin D1是Fu等〔7〕從甲狀旁腺腺瘤中克隆、鑒定出來的一種細(xì)胞周期蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，Cyclin D1過表達(dá)可導(dǎo)致G1期縮短，降低細(xì)胞對(duì)外源性有絲分裂刺激的依賴性〔8〕，使腫瘤細(xì)胞不依賴于細(xì)胞外生長(zhǎng)信號(hào)的刺激而反復(fù)自發(fā)進(jìn)行細(xì)胞周期循環(huán)。

TCS在臨床上主要用于引產(chǎn)及宮外孕、葡萄胎、絨癌等疾病的治療，因其具有N糖苷酶活性，使核糖體發(fā)生不可逆性失活而抑制蛋白質(zhì)的合成〔9〕，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TCS對(duì)結(jié)腸癌、肺癌、黑色素瘤等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用〔1〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TCS能通過誘導(dǎo)凋亡抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)顯示TCS能明顯抑制PC3細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，TCS對(duì)PC3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用逐漸增大，具有時(shí)間及劑量依賴性。TCS抑制Pca細(xì)胞增殖的可能機(jī)制為TCS能抑制ERK磷酸化從而抑制ERK-MAPK信號(hào)通路活性，TCS誘導(dǎo)的G1期阻滯與前列腺癌抑制細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin D1的表達(dá)有關(guān)。對(duì)前列腺癌抗癌機(jī)制的進(jìn)一步研究，有望使其應(yīng)用于前列腺癌等腫瘤的臨床治療。

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8 Seo JH，Jeong ES，Choi YK.Therapeutic effects of lentivirus-mediated shRNA targeting of cyclin D1 in human gastric cancer〔J〕.BMC Cancer，2014;14:175-80.

9 汪 猷，金善煒.天花粉蛋白〔M〕.第2版.北京:科學(xué)出版社，2000:158.

10 黃益玲，胡火軍，黃利鳴，等.天花粉蛋白誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007;23(1):99-101.

〔2014-12-03修回〕