王曉勛李瑞明陳敏賀嬌尹霞胡巧林梅俊吳慧超

鄂西北及周邊地區(qū)漢族人群D2S1338和D19S433基因座多態(tài)性分析與調(diào)查

王曉勛1★李瑞明2陳敏3賀嬌4尹霞4胡巧林4梅俊4吳慧超4

目的 采集鄂西北及周邊地區(qū)漢族人群無關(guān)個體血樣，進行STR等位基因座D2S1338 和D19S433多態(tài)性分析。 方法 應(yīng)用chelex提取DNA，AmpFISTR Identifiler試劑盒擴增，毛細管電泳分型。 結(jié)果 在被檢測的387位無關(guān)個體中等位基因座D2S1338和D19S433分別檢出14和17個等位基因型以及兩個等位基因的分布頻率，基因座等位基因分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡。 結(jié)論 得到一些適合本地區(qū)應(yīng)用的等位基因的頻率，為以后司法物證鑒定工作提供參考。

STR；等位基因頻率；統(tǒng)計分析；Hardy-Weinberg平衡

［ABSTRACT］Objective To analyze the distribution frequency of D2S1338 and D19S433 loci alleles in region of Han Nationality around Northwest Hubei Province based on the particular area population database.Methods DNA was extracted from sample using chelex-100，amplified by AmpFISTR Identifiler kit and typed by capillary electrophoresis.Results Among 387 unrelated individuals，14 alleles were detected in D2S1338 locus and 17 alleles in D19S433 locus.The genotype frequencies of these alleles were consistent with Hardy-Weinberg equilibrium.Conclusion Allele frequencies acquired in this study provides a reference for evidence identification of forensic science in Shiyan.

［KEY WORDS］STR；Allele frequency；Statistical analysis；Hardy-Weinberg equilibrium

為了得到適合本地區(qū)應(yīng)用的等位基因座中等位基因的分布頻率，本文應(yīng)用ABI AmpFISTR Identifiler STR分型試劑盒，采用復合PCR技術(shù)對D2S1338和D19S433等位基因座各等位基因分布頻率、統(tǒng)計數(shù)據(jù)和突變進行分析，得到相關(guān)頻率的數(shù)據(jù)，并將其應(yīng)用到法醫(yī)親權(quán)鑒定和個體識別等法醫(yī)物證實驗當中。

1 材料與方法

1.1 樣本

采集387名無關(guān)個體的血液標本，用FTA卡收集血液標本，用于等位基因座各等位基因的分布頻率調(diào)查，350例單親親權(quán)鑒定檢材用于案例檢測。

1.2 方法

1.2.1 標本的收集和處理

收集血液標本，用chelex法提取DNA。 定量后用于復合PCR擴增，采用的試劑盒是ABI AmpFISTR Identifiler Kit。

1.2.2 樣本的電泳和數(shù)據(jù)收集

反應(yīng)體積 12.5 μL，PCR反應(yīng)條件是 94℃11 min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min 共28個循環(huán)；最后60℃ 1 h，甲酰胺淬冷變單鏈，ABI 310毛細管電泳。收集數(shù)據(jù)，應(yīng)用Genscan 3.7 和Genotyper 3.7完成等位基因分型。

1.2.3 統(tǒng)計數(shù)據(jù)的分析

應(yīng)用統(tǒng)計軟件Modified-powerstate［1］標準版統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

收集兩種等位基因座D2SS1338、D19S433各等位基因的分布頻率，對各等位基因分布做χ2檢驗，計算等位基因雜合度（henterozygosity，H），個體識別能力 （probability of discrimination power，DP），非父排除率（excluding probability of paternity，PE），多態(tài)信息量（polymorphic information content，PIC）。所用軟件為Modified-powerstate標準版［1］。

2 結(jié)果

2.1 等位基因基因型的分布規(guī)律

在本實驗中D2S1338基因座共檢測出14個等位基因，D19S433基因座則檢出 17個等位基因，用Modified-powerstate統(tǒng)計387名無關(guān)個體等位基因座各等位基因的分布頻率，統(tǒng)計方法按數(shù)分類法，統(tǒng)計結(jié)果見表1。用軟件統(tǒng)計基因型實際觀測值值和理論值做χ2檢驗，顯示兩組數(shù)據(jù)無顯著性差異，經(jīng)過Modified-powerstate統(tǒng)計計算提示統(tǒng)計觀察的基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡，結(jié)果見表2。

表1 等位基因座D2S1338和D19S433各等位基因分布頻率Table 1 Frequency distribution of D2S1338 and D19S433 locus allele

表2 D2S1338和D19S433等位基因分布規(guī)律（Hardy-Weinberg平衡）Table 2 Distribution of D2S1338 and D19S433 allele （Hardy-Weinberg equilibrium）

2.2 基因座D2S1338和D19S433的統(tǒng)計分析

對 387名無關(guān)個體基因座 D2S133和D19S433使用統(tǒng)計軟件 Modified-powerstate進行統(tǒng)計，得到H，DP，PE，PIC。結(jié)果見表3。

2.3 群體中家系的調(diào)查

分析了 350例親權(quán)鑒定，顯示 D2S1338和D19S433等位基因座符合常染色體共顯性遺傳特征，符合孟德爾遺傳規(guī)律［1］，在350例親權(quán)鑒定中，700個減數(shù)分裂中發(fā)現(xiàn)一例位于基因座D19S433的等位基因突變。本例進行了家庭關(guān)系調(diào)查，加做了生母等位檢查，增加了5個等位基因座位點和Y染色體檢查，確定此不符合遺傳規(guī)律是由于父系在遺傳給孩子的過程中發(fā)生逐步突變，導致在此基因座位點上孩子等位基因12和擬父的等位基因11、13相差一個重復序列，增加或減少了4 bp。見表4。

表3 D2S1338、D19S433基因座統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析Table 3 Statistical data analysis of D2S1338，D19S433 locus

表4 D19S433觀察到的一例突變Table 4 Mutations of D19S433 loci observed in one case

2.4 實例分析

本文分析了350例由ABI identifiler所做的親權(quán)鑒定，在CODIS數(shù)據(jù)認定的有親緣關(guān)系的247例中，基因座 D2S1338和 D19S433除一例D19S433突變，全部符合孟德爾遺傳規(guī)律。在被CODIS基因座位點排除親權(quán)關(guān)系的103例中，其中D2S1338有68例得到排除，排除率為66.02%。在D19S433基因座中有 76例得到排除，排除率為73.79%。

在發(fā)生的一例雙親親權(quán)鑒定中，除了基因座D19S433外，其它基因座等位基因皆符合孟德爾遺傳規(guī)律，考慮到此位點與擬父的此位點等位基因存在逐步突變，由于孩子為男孩，詳細詢問被鑒定人的家庭情況，在追加的5個基因座皆符合孟德爾遺傳規(guī)律，檢測Y染色體基因座位點后完全符合，所以推斷此位點的不符合是由于STR復制滑動錯配所致的一步突變［2］，考慮到突變對CPI和RCP的影響后得出其是具有親緣關(guān)系的結(jié)論。

3 討論

D2S1338基因座位于染色體2q35～3711位，D19S433基因座等位于染色體19q12～1311。ABI identifiler其引物擴增片段大小分別為 289～341 bp和106～140 bp［3］。在本文總共387例分析中D2S1338等位基因座共檢測出14個等位基因和57個等位基因型，D19S433基因座共檢測出17個等位基因和50個等位基因型。在D19S433基因座等位基因檢測中發(fā)現(xiàn)一例一步滑動突變，滑動突變頻率遵從逐步突變的原則［2］。這種突變會導致親權(quán)鑒定中父權(quán)指數(shù)的降低，使得對結(jié)果的判斷產(chǎn)生困難，應(yīng)引起關(guān)注。對D21338和D19S433基因座進行統(tǒng)計分析，得到每個等位基因座H，DP，PE，PIC，等位基因分布頻率等。H，DP，PE，PIC是衡量一個遺傳標記物在法醫(yī)學、遺傳疾病基因連鎖分析、人類學和群體遺傳學等研究領(lǐng)域應(yīng)用價值的指標，一般將DP≥0.9，H≥0.7，PIC≥0.7的基因座作為高鑒別力的遺傳標記物［3，4-8］。從表 3可以看出等位基因座D2S1338和D19S433均屬于高識別力、高雜合度、高信息量的等位基因座，有著非常重要的應(yīng)用價值。對觀察值和理論值進行分析看是否符合Hardy-Weinberg平衡，表2結(jié)果顯示觀測值與理論值沒有差異，觀測的指標和統(tǒng)計學數(shù)據(jù)可以代表本地區(qū)總體分布的情況。這些分析統(tǒng)計得到結(jié)果為本地區(qū)應(yīng)用此等位基因頻率奠定了基礎(chǔ)。

不同的等位基因頻率所計算得出的父權(quán)指數(shù)大小并不相同。有資料表明，同一基因座在不同人群或不同研究中調(diào)查所得的等位基因頻率可能會不相同［2］。對于單獨一個基因座，同一親權(quán)鑒定案例用不同群體的等位基因頻率計算所得的 PI值是不同的。我們比較了4組不同人群中這兩種等位基因座等位基因的頻率也提示了這種結(jié)論［3-5，9-11］。呂德堅等人描述用 CODIS基因座的不同群體等位基因頻率計算所得的 CPI最大值與最小值之比可達100～1 000倍以上［2］，反映出即使聯(lián)合應(yīng)用多個遺傳標記仍有相當一部分案例的 CPI值因等位基因頻率的影響而有較大的差異［3］。所以獲得本地區(qū)這2個等位基因座等位基因頻率可以避免本地漢族由于采用不同人群中基因座等位基因的分布頻率導致結(jié)果差異較大的問題。建議在個體識別和親權(quán)鑒定中使用適合自己人群等位基因座等位基因的分布頻率。或使用基因座等位基因頻率分布最高者，即“上限頻率（ceiling frequency）”來計算以獲得一個保守值［3］，也提示對于父權(quán)概率很低的案例，除了增加更多的等位基因座等位基因檢測外，可以考慮不排除父權(quán)概率避免了特定個體等位基因頻率的影響［3］。

4 結(jié)論

本文通過對十堰漢族人群387個無關(guān)個體D2S1338和D19S433等位基因座等位基因頻率的和基因型的檢測和統(tǒng)計分析。建立了適合本地區(qū)等位基因座等位基因頻率資料可以更客觀的反應(yīng)這些等位基因本地區(qū)人群中的分布，此基因頻率也可以作為中國大陸人群等位基因頻率統(tǒng)計的一部分，避免由于不同人群頻率的不同導致父權(quán)指數(shù)過大或過小導致最后結(jié)果差異較大的問題。為以后本地區(qū)司法物證鑒定工作提供參考。

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Analysis of polymorphism of D2S1338 and D19S433 loci in Han population in northwest Hubei province

WANG Xiaoxun1★，LI Ruiming2，CHEN Min3，HE Jiao4，YIN Xia4，HU Qiaolin4，MEI Jun4，WU Huichao4
（1.Laboratory of Forensic Evidence，Inspection Department of Taihe Hospital，Shiyan，Hubei，China，442000；2.Biomedical Institute of Taihe Hospital，Shiyan，Hubei，China，442000；3.Sanyan Out-patient Depatment of Xiyuan Hospital，Shiyan，Hubei，China，442000；4.Second Clinical College，Hubei University of Medicine，Shiyan，Hubei，China，442000）

國家自然科學基金（81171783）

1.湖北省十堰市太和醫(yī)院檢驗部法醫(yī)物證實驗室，湖北，十堰 442000 2.湖北省十堰市太和醫(yī)院生物醫(yī)學研究所，湖北，十堰442000 3.湖北省十堰市西苑醫(yī)院三堰門診部，湖北，十堰 442000 4.湖北省十堰市湖北醫(yī)藥學院第二臨床學院，湖北，十堰 442000

王曉勛，E-mail：524910@qq.com