吳成將陳健明藍(lán)艷羅宏成向陽(yáng)王春芳韋葉生★

廣西壯族及漢族人群CD40配體基因rs7050168G/A遺傳多態(tài)性

吳成將1陳健明1藍(lán)艷2羅宏成1向陽(yáng)1王春芳1韋葉生1★

目的 研究CD40配體基因rs7050168G/A位點(diǎn)多態(tài)性在廣西壯族及漢族人群中的分布，同時(shí)比較其在不同種族人群間以及同一種族不同性別之間，基因型和等位基因頻率分布的差異。

方法采用單堿基延伸PCR（PCR-SBE）的方法，分析201名廣西漢族人和199名廣西壯族人的CD40配體基因rs7050168G/A多態(tài)性。 結(jié)果 CD40配體基因rs7050168G/A位點(diǎn)表現(xiàn)出AA、AG和GG三種基因型，其在壯族人中的頻率分別為97.0%、1.5%和1.5%，而在漢族人中頻率分別為98.0%、1.0%和1.0%。CD40配體基因多態(tài)性在在廣西壯族和漢族人群之間比較差異都沒(méi)有顯著性（P均＞0.05）。進(jìn)一步將廣西漢族人群分型數(shù)據(jù)同人類(lèi)基因組計(jì)劃公布的4個(gè)人群相比，我們發(fā)現(xiàn)在廣西漢族人群中CD40配體基因rs7050168G/A位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與日本和北京人群比較，差異均具有顯著性 （P均＜0.05），但與歐洲和非洲人群比較，差異沒(méi)有顯著性（P均＞0.05）。 結(jié)論 在廣西地區(qū)壯族及漢族人群中存在著CD40配體基因多態(tài)性，其基因多態(tài)性的分布頻率沒(méi)有顯著性的差異，但與其他種族人群比較存在著顯著差異。這種差異可能是導(dǎo)致一部分疾病在不同種族人群之間的臨床表現(xiàn)以及發(fā)病率存在顯著不同的因素之一。

CD40；基因多態(tài)性；種族

［ABSTRACT］Objective To study gene polymorphism at rs7050168G/A of CD40 ligand in Guangxi Zhuang and Han populations，and to compare distributions of allele and genotype frequencies among different races and different gender in the same race.Methods The frequency of CD40 ligand gene rs7050168G/A allele and genotype were detected by using the method of polymerase chain reaction-single base extension （PCR-SBE）in 201 Guangxi Han and 199 Guangxi Zhuang populations.Results The genotype frequencies of AA，AG and GG of rs7050168G/A was 97.0%，1.5%and 1.5%in the Zhuangs，and 98.0%，1.0%and 1.0%in the Hans respectively.The frequencies of allele and genotype distribution of CD40 ligand geners7050168G/A polymorphism were not significant difference between the Zhuangs and the Hans （P＞0.05）.There were significant difference as compared with HapMap-JPT and HapMap-HCB （both P＜0.05），but compared with HapMap-CEU and HapMap-YRI，the CD40L polymorphism were not significantly difference （P＞0.05）.Conclusion There are CD40 ligand gene polymorphism in Guangxi Zhuang and Han populations.The frequencies of polymorphism distribution of CD40 ligand gene were not significant difference between the Zhuang and Han populations， whose distributions are significantly difference compared with others ethnic populations.The variation of CD40 ligand gene polymorphism among different ethnic groups might account for the varied clinical spectrum of some CD40 ligand related diseases.

［KEY WORDS］CD40 ligand；Polymorphism；Ethnic

CD40配體即CD40L，是TNF超家族的主要成員之一，表達(dá)于CD4+T細(xì)胞、柱狀細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和血小板上，是一種分子量為39KD的Ⅱ型跨膜糖蛋白。CD40配體是體液和細(xì)胞免疫的中樞分子，與其受體CD40相互作用，作為T(mén)、B細(xì)胞活化的第二信號(hào)，介導(dǎo)T細(xì)胞依賴(lài)的B細(xì)胞活化和效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生，在體液免疫和細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。人CD40配體基因定位于 X染色體的 q26.3-q27.1區(qū)，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。分子生物學(xué)研究表明，CD40配體基因存在著單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），這種基因多態(tài)性與人類(lèi)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、腎移植排斥反應(yīng)及多發(fā)性硬化癥的關(guān)系，已成為國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者研究的熱點(diǎn)［1-5］。因此本研究采用單堿基延伸的PCR技術(shù)和基因測(cè)序法來(lái)研究廣西地區(qū)壯族及漢族兩個(gè)種族人群的CD40配體基因單核苷酸多態(tài)性，并將其分型數(shù)據(jù)與人類(lèi)基因組計(jì)劃已經(jīng)公布的4組人群（歐洲人、非洲人、日本人和中國(guó)北京人）進(jìn)行比較，以探討基因多態(tài)性在不同種族正常人群中的分布差異為與CD40配體相關(guān)的疾病和遺傳等方面的研究提供一些基礎(chǔ)性的參考資料。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

隨機(jī)選取了來(lái)自廣西各地區(qū)在我院體檢健康且相互之間無(wú)血緣關(guān)系的400人。其中選取了廣西漢族男性109人，女性92人，共201人，年齡均在22～84歲；廣西壯族男性116人，女性83人，共199人，年齡均在25～83歲。所有對(duì)象的臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

用EDTA-K2抗凝管采集以上人群靜脈血3 mL，全血基因組DNA提取，參照已建立的改良碘化鈉法［6］。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)CD40配體基因rs7050168G/A位點(diǎn)多態(tài)性和已知的DNA序列，用在線Primer3軟件（http：//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi）設(shè)計(jì)PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴(kuò)增 CD40配體基因包含rs7050168G/A位點(diǎn)堿基的DNA片段的引物，上游引物序列為：5′-CTTTTCCCCTGGGACCCAATT T-3′；下游引物序列為：5′-AATACCCCATGAGG CCCATTTC-3′；延伸引物為：5′-TTCCTCCTTT TGTCCCTCTAAGTCCCA-3′。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

CD40配體的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中包含了 10×PCR緩沖液2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上游引物、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足體積均用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR產(chǎn)物用Qiagen公司的HotStarTaq進(jìn)行多重PCR來(lái)獲得，PCR產(chǎn)物通過(guò)蝦堿酶（SAP）（from Promega）和外切酶I（EXO I）（from Epicentre）經(jīng)過(guò)純化后，用ABI公司的 SNaPshot Multiplex kit進(jìn)行延伸反應(yīng)。延伸產(chǎn)物采用蝦堿酶（SAP）（from Promega）純化后在 ABI3130XL上樣。SNP分型采用GeneMapper4.0（Appliedbiosystems）來(lái)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

CD40配體基因型和等位基因頻率均采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，各組間基因型和等位基因頻率比較均采用χ2檢驗(yàn)，用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行分析，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。

2 結(jié)果

2.1 CD40配體基因型檢測(cè)結(jié)果

CD40配體基因 rs7050168G/A多態(tài)性，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為297bp。經(jīng)ABI3130XL基因檢測(cè)儀SNP分型，其結(jié)果顯示出rs7050168G/A位點(diǎn)檢測(cè)到了AA、AG和GG三種基因型?；驕y(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的分型結(jié)果 （圖 1）。

圖1 CD40配體基因rs7050168G/A測(cè)序圖

2.2 CD40配體基因多態(tài)性在廣西壯族和廣西漢族人群中分布頻率的比較

根據(jù)人類(lèi)基因組CD40配體基因SNP的數(shù)據(jù)庫(kù)資料，我們選擇rs7050168G/A位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性的分析。這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在男女之間比較，差異都沒(méi)有顯著性 （P均 ＞0.05）。同時(shí)這個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率在廣西壯族和漢族人群之間比較，差異同樣沒(méi)有顯著性（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 廣西壯族和漢族人群CD40配體基因rs7050168G/A基因型和等位基因分布頻率的比較Table 1 Comparisons of distribution of genotype and allele frequencies of CD40 ligand gene rs7050168G/A in Guangxi Zhuang and Han populations

2.3 CD40配體基因多態(tài)性在不同種族人群間的比較

將廣西漢族人群CD40配體基因多態(tài)性分布頻率分別與人類(lèi)基因組計(jì)劃公布（Hapmap）的4個(gè)種族人群比較，結(jié)果顯示CD40配體基因的基因型和等位基因頻率同日本和北京人群相比，差異都有顯著性 （P均＜0.05），但同歐洲及非洲人群相比，差異都沒(méi)有顯著性（P均＞0.05）。此外，我們將CD40配體基因rs7050168G/A多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在非洲人群和廣西壯族人群間比較，發(fā)現(xiàn)等位基因頻率存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同種族及地區(qū)人群CD40配體基因rs7050168G/A多態(tài)性分布頻率的比較Table 2 Comparisons of frequency of CD40 ligand gene rs7050168G/A polymorphism among different ethic and regional groups

3 討論

在人類(lèi)基因組中，基因多態(tài)性是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象，其在闡明人體對(duì)疾病、毒物的易感性與耐受性，疾病臨床表現(xiàn)的多樣性，以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性上都起著重要的作用。而在研究某些疾病基因的多態(tài)性分布時(shí)，首先了解其在不同種族正常人群中的分布情況，是正確分析疾病與基因多態(tài)性之間關(guān)系的基礎(chǔ)。廣西是一個(gè)多民族聚居的區(qū)域，有48個(gè)以上民族長(zhǎng)期共存，其中有12個(gè)世居民族。通過(guò)對(duì)這些不同民族基因多態(tài)性的研究，有助于發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性在不同種族人群中的分布規(guī)律。因此，本文將CD40配體基因多態(tài)性在廣西漢族和廣西壯族人群中進(jìn)行對(duì)比研究，從而為探索一些疾病在不同種族間的遺傳規(guī)律，提供一些前瞻性的基礎(chǔ)資料。

CD40配體也稱(chēng)gp39或CD40L，為腫瘤壞死因子超家族成員，主要存在于活化的CD4+T淋巴細(xì)胞表面，提供B淋巴細(xì)胞活化所必需的協(xié)同刺激信號(hào)， 在巨核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、外周血嗜堿性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、B細(xì)胞、和單核細(xì)胞的表面也有少量表達(dá)。大量研究發(fā)現(xiàn)，CD40配體是一個(gè)重要的致病因子，通過(guò)與其受體CD40特異性結(jié)合而在許多疾病形成和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，如通過(guò)誘導(dǎo)干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-8等細(xì)胞粘附分子在活化的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)而啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化；此外也參與移植排斥反應(yīng)、內(nèi)皮損傷、血小板活化、血栓形成、血管形成、腦損傷等病理過(guò)程［7-9］。CD40配體基因位于X染色體的q26.3-q27.1包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，CD40配體基因存在著單核苷酸多態(tài)性（SNP），這種基因多態(tài)性可能影響到CD40配體基因的功能，進(jìn)而可能影響到CD40配體基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。Bilińska等［10］研究發(fā)現(xiàn) CD40配體基因多態(tài)性影響著多發(fā)性硬化癥等自身性疾病的發(fā)生和發(fā)展；Zhao［11］和王新等［12］研究表明CD40配體基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈病變程度密切相關(guān)。

利用單堿基延伸PCR技術(shù)（PCR-SBE），我們對(duì)來(lái)自廣西地區(qū)的壯族和漢族人群中CD40配體基因 rs7050168G/A多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。將rs7050168G/A多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在廣西壯族和漢族之間以及男女性別之間進(jìn)行比較，結(jié)果表明差異均無(wú)顯著性（P均＞0.05）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)廣西漢族人群的rs7050168G/A多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與日本和北京人群比較，差異都具有顯著性（P均＜0.05），但同歐洲和非洲人群比較，差異沒(méi)有相關(guān)性 （P均＞0.05）。此外CD40配體基因rs7050168G/A多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因頻率在非洲人群和廣西壯族人群之間也存在著顯著差異（P＜0.05），造成此結(jié)果的可能原因是由于生存環(huán)境、飲食習(xí)慣、生活方式等的不同引起。從本文結(jié)果可以看出，CD40配體基因型分布和等位基因頻率在不同種族間存在著明顯的差異。

總之，對(duì)中國(guó)廣西壯族和漢族人群CD40配體基因多態(tài)性的研究，不僅為CD40配體基因多態(tài)性與臨床疾病相關(guān)性的研究分析提供了前瞻性的基礎(chǔ)資料，而且也為進(jìn)一步的人類(lèi)學(xué)及群體遺傳學(xué)的研究和基因多態(tài)性普查奠定了基礎(chǔ)。

［1］Liao J，Liang G，Xie S，et al.CD40L demethylation in CD4+T cells from women with rheumatoid arthritis［J］.Clin Immunol，2012，145（1）：13-18.

［2］Winkels H，Weber C，Lutgens E，et al.Atherosclerosis：cell biology and lipoproteins focus on iNKT cells and CD40/CD40L in atherosclerosis and metabolic disorders ［J］.Curr Opin Lipidol，2014，25（5）：408-409.

［3］Ohashi Y，Okazaki H，Sato T，et al.Function of CD40/ CD40L in peritubularcapillary ofrenalallograft rejection［J］.Transplant Proc，2001，33（1-2）：407-408.

［4］Wagner M， Wisniewski A， Bilinska M， et al.Investigation of gene-gene interactions between CD40 and CD40L in Polish multiple sclerosis patients［J］.Hum Immunol，2014，75（8）：796-801.

［5］ 吳甜，郭韌，張畢奎.CD40/CD40L基因及其多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化的研究進(jìn)展［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，37（4）：413-418.

［6］ 藍(lán)艷，羅斌，韋彩成，等.中國(guó)廣西人群Nogo-B基因內(nèi)含子區(qū)遺傳多態(tài)性的研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（22）：1-4.

［7］Hausding M，Jurk K，Daub S，et al.CD40L contributes to angiotensin II-induced pro-thrombotic state，vascular inflammation，oxidative stress and endothelial dysfunction［J］.Basic Res Cardiol，2013，108（6）：386.

［8］Bou Khzam L，Boulahya R，Abou-Saleh H，et al.Soluble CD40 ligand stimulates the pro-angiogenic function of peripheral blood angiogenic outgrowth cells via increased release of matrix metalloproteinase-9［J］.Plos One，2013，8（12）：e84289.

［9］Lorente L，Martín MM，González-Rivero AF，et al.Serum soluble CD40 Ligand levels are associated with severity and mortality of brain trauma injury patients［J］.Thromb Res，2014，134（4）：832-836.

［10］Bilińska M， Frydecka I， Kosmaczewska A， et al.CD40L expression on CD4+T lymphocytes from peripheral blood in patients with relapsing-remitting and secondary progressive multiple sclerosis［J］.Pol Merkur Lekarski，2006，20（115）：41-45.

［11］Zhao W，Zhang F，Li Z，et al.Soluble CD40 ligand is associated with angiographic severity of coronary artery disease in patients with acute coronary syndrome［J］.Chin Med J（Engl），2014，127（12）：2218-2221.

［12］王新，劉群.中國(guó)人群CD40L G基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)急性冠狀動(dòng)脈綜合征影響的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2012，20（1）：64-68.

The genetic polymorphism of rs7050168G/A CD40 ligand gene in Guangxi Zhuang and Han populations

WU Chengjiang1，CHEN Jianming1，LAN Yan2，LUO Hongcheng1，XIANG Yang1，WANG Chunfang1，WEI Yesheng1★
（1.Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise，Guangxi，China，533000；2.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise，Guangxi，China，533000）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81260234）；廣西自然科學(xué)基金（2011GXNSFA018198）；廣西衛(wèi)生廳重點(diǎn)科研課題 （重2012086）

1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西，百色 533000 2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西，百色 533000

韋葉生，E-mail：wysh22@163.com