紅梅 周健 陳蒙恩等

摘要：采用響應(yīng)面法從傳統(tǒng)大曲中篩選的異常威克漢姆酵母J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酵母菌株J7發(fā)酵產(chǎn)物中大曲重要香味物質(zhì)苯乙醇的色譜峰面積為響應(yīng)值，原料初始水分含量、裝料量、發(fā)酵溫度為自變量，利用響應(yīng)面中心組合法進行試驗設(shè)計，并做響應(yīng)面分析和優(yōu)化。結(jié)果表明，在發(fā)酵溫度為35 ℃，初始水分含量為43%，裝料量為70 g/250 mL的最優(yōu)條件下發(fā)酵9 d，苯乙醇的色譜峰面積的平均值為1.332×108，接近于模型預(yù)測值1.324×108，此時發(fā)酵產(chǎn)物中的苯乙醇含量為6.350 mg/100 g，與優(yōu)質(zhì)濃香型大曲相比，其含量增長了5倍多。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；異常威克漢姆酵母；濃香型大曲；苯乙醇

中圖分類號：TS261.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）14-3492-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.14.041

Optimization of Phenylethanol Fermentation Conditions of Wickerhamomyces anomalus from Daqu by Response Surface Methodology

MING Hong-mei， ZHOU Jian， CHEN Meng-en， GUO Zhi ，YAO Xia， LIU Yu-meng

（College of Bioengineering， Sichuan University of Science &Engineering， Zigong 643000， Sichuan， China）

Abstract：Response surface methodology was applied to optimize the phenylethanol fermentation conditions of Wickerhamomyces anomalus from Daqu. On the basis of single factor test， the optimization about dependent variables （phenylethanol the main flavoring substances chromatographic peak area） and independent variables （fermentation temperature， loading weight and moisture content） was carried out by using central composite design. The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows： fermentation temperature 35 ℃， 43% moisture， loading weight of 70 g/250 mL. Fermentation 9 days under the conditions， the average peak area of phenylethanol for 1.332×108， which were well matched with the predictive value 1.324×108， the content of the fermentation product of phenylethanol as 6.350 mg/100 g， compared with the high-quality Luzhou Daqu， phenylethanol content increased more than 5 times.

Key words：response surface methodology；Wickerhamomyces anomalus；strong-flavor Daqu；phenylethanol

大曲是濃香型白酒釀造的發(fā)酵劑和生香劑。大曲的生香功能是普通酶制劑所不能取代的，大曲的復(fù)合曲香香氣的融入及其在釀造體系內(nèi)的進一步生化演化，賦予了傳統(tǒng)濃香型白酒獨特的風(fēng)格特征[1]。苯乙醇是一種具有玫瑰香氣的芳香醇[2]，是大曲中的重要香味成分，亦是白酒香味成分及其前體物質(zhì)[3，4]。除此以外，苯乙醇在醬油、果酒、面包等發(fā)酵食品中也含量豐富，是一種可用于食品的香料添加劑。隨著人們對綠色食品及食品安全意識的增強，對添加化學(xué)香料香精存有的強烈爭議，天然的食品香料添加劑的研發(fā)成為新的熱點[5]。

響應(yīng)面法是統(tǒng)計方法與數(shù)學(xué)方法結(jié)合的產(chǎn)物，是用來對關(guān)注的、受多個變量影響的問題進行建模分析、最終進行優(yōu)化的方法。目前在食品及生物等領(lǐng)域[6-8]應(yīng)用較廣。本研究以傳統(tǒng)濃香型大曲中分離獲得的一株產(chǎn)香異常的威克漢姆酵母為菌種，小麥固體培養(yǎng)基為底物，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法進一步優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的條件，以期為白酒生產(chǎn)中香曲的制備及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：異常威克漢姆酵母J7，從瀘州老窖“久香”牌中高溫濃香型大曲中分離獲得。

酵母活化培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，葡萄糖10 g，孟加拉紅0.033 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂18.5 g，去離子水1 000 mL，121 ℃下滅菌20 min。

酵母種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母浸出膏10 g，去離子水1 000 mL，pH 5.0～5.5，分裝于試管中，121 ℃下滅菌20 min。

小麥固體培養(yǎng)基：稱取經(jīng)適度粉碎的小麥適量，調(diào)節(jié)水分含量為40%左右，置于250 mL三角瓶中，121 ℃下滅菌20 min。

儀器與設(shè)備：SW-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；THC-330型搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MJ-250型恒溫培養(yǎng)箱，上海和羽電子科技有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；手動SPME進樣器，美國Supelco公司；15 mL帶硅橡膠墊的樣品瓶，美國Supelco公司；Agilent 6890N-5975B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 固態(tài)產(chǎn)香試驗 菌株J7經(jīng)活化后接入種子培養(yǎng)基，在28 ℃下培養(yǎng)48 h后調(diào)節(jié)種子液濃度至107個/mL。滅菌冷卻后的小麥固體培養(yǎng)基中加入液化酶（10 U/g原料）、糖化酶（100 U/g原料）、酸性蛋白酶（20 U/g原料），酶制劑均用去離子水溶解并用0.22 μm濾膜除菌，然后以10%接種量接入菌株J7種子液，于28 ℃下發(fā)酵9 d后對其發(fā)酵產(chǎn)物進行感官評定、揮發(fā)性成分定性和半定量分析。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物感官評定 評定小組由10名專業(yè)人員組成，對各試驗組發(fā)酵產(chǎn)物進行外觀、氣味評定。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)檢測[9] 固相微萃取條件：將發(fā)酵產(chǎn)物研磨后精確稱取4.0 g，于15 mL進樣瓶中60 ℃水浴平衡15 min，經(jīng)頂空吸附30 min、230 ℃氣質(zhì)聯(lián)用儀解析3 min后進行鑒定。氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-WAX，規(guī)格為（60 m×250 μm，0.25 μm）；手動進樣，進樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始40 ℃穩(wěn)定1 min后，以3 ℃/min的速率升至180 ℃，再以2.5 ℃/min升至230 ℃，穩(wěn)定10 min；氣化室溫度250 ℃；載氣He，流速1 mL/min。質(zhì)譜條件：EI電離源，掃描范圍20～500 u，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，接口溫度230 ℃。

1.2.4 揮發(fā)性物質(zhì)定性與半定量分析 定性分析：將發(fā)酵產(chǎn)物中檢出的揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)譜圖與標準譜庫（NIST）進行比對，匹配度>800的結(jié)果予以公布。半定量分析：以正丁醇為內(nèi)標，將樣品揮發(fā)性物質(zhì)的濃度與正丁醇質(zhì)量濃度作比進行計算。

1.2.5 單因素試驗 采用單一變量法，依次改變發(fā)酵溫度（23、28、33、38、43 ℃）、裝料量（10、40、70、100、130 g/250 mL）及初始水分含量（26%、34%、42%、50%、58%）對菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的影響，并對較佳發(fā)酵參數(shù)進行選取。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以大曲重要香味物質(zhì)苯乙醇的色譜峰面積為評價指標，進行17組5個中心點的Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及分析[10-12]，最終確定最佳發(fā)酵參數(shù)。所有試驗除非特殊說明均設(shè)3個重復(fù)，其各因素與水平見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 溫度對菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的影響 通過設(shè)置不同的溫度研究其對菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株J7在33 ℃下發(fā)酵時產(chǎn)苯乙醇含量最高。苯乙醇可由苯丙氨酸轉(zhuǎn)化而來，其含量與蛋白酶活性及產(chǎn)香酵母的生長代謝有關(guān)[13]，當溫度過低時，不利于蛋白酶的催化作用及酵母菌的生長繁殖；隨著溫度的升高，蛋白酶水解作用增強，氨基酸生成量增多，酵母菌大量生長繁殖，有利于苯乙醇的積累；當溫度超過40 ℃時，酵母菌的生長受到抑制，酶的穩(wěn)定性也會下降，33 ℃為酶、菌協(xié)同作用的較佳溫度。因此，選取30、33、36 ℃作為菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的響應(yīng)面試驗參數(shù)，以確定最佳發(fā)酵溫度。

2.1.2 裝料量對菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的影響 通過設(shè)置不同的裝料量研究其對菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，苯乙醇的色譜峰面積在裝料量為70 g/250 mL附近時為較大值。裝料量過多或過少均會影響苯乙醇的生成量，裝料量過少時，雖基質(zhì)溶氧量較高，但不利于保溫，因而影響蛋白酶的催化作用及酵母菌的生長繁殖，當裝料料量過大時，基質(zhì)中溶氧量過低菌體生長代謝受到抑制，同時產(chǎn)生的熱量不利于散失，也會導(dǎo)致酵母菌和酶的失活，致使苯乙醇生成量降低。因此，選取裝料量50、70、90 g/250 mL作菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的響應(yīng)面試驗參數(shù)，以確定最佳裝料量。

2.1.3 水分含量對菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的影響 通過設(shè)置不同的初始水分含量研究其對菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，苯乙醇的含量隨著水分含量的增大呈現(xiàn)一個先增加后降低的趨勢。水分含量過低時，不利于蛋白酶的水解作用及產(chǎn)香酵母的生長繁殖，當水分含量過高時可能導(dǎo)致小麥基質(zhì)的透氣性下降，影響菌體的生長代謝，因而苯乙醇的生成量降低。苯乙醇色譜峰面積在水分含量為42%附近時出現(xiàn)較大值，因此選取水分含量34%、42%、50%作菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的響應(yīng)面試驗參數(shù)，以確定最佳水分含量。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵苯乙醇條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 對菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇條件進行響應(yīng)面分析，具體試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。運用Design-Expert8.0.6軟件進行二次回歸擬合后，得到以下回歸方程：

Y=1.378×108+8.084×105A+2.466×106B+5.185×106C-2.420×106AB-3.072×106AC-4.171×106BC-1.374×107A2-1.251×107B2-1.125×107C2。

回歸模型方差分析見表3。由表3可知，模型的P值小于0.01，F(xiàn)值為35.193。由方差分析可知，模型失擬項中P>0.05，說明該模型選擇比較合理。B、C、BC、A2、B2、C2的P值小于0.05，表明這些因素對模型顯著，該方程對試驗擬合情況較好。模型R2為97.8%，表明該模型與實際情況擬合良好，可以用于菌株J7最佳發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇條件的分析和預(yù)測。

2.2.2 各因素之間的交互作用 利用響應(yīng)面回歸分析、回歸方程和Design-Expert 8.0.6軟件繪制三維響應(yīng)曲面圖，探究兩因素間交互作用對產(chǎn)香酵母J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的影響，結(jié)果見圖4至圖6。由圖4至圖6可以看出，溫度、裝料量和初始水分含量對產(chǎn)香酵母J7發(fā)酵產(chǎn)香的影響均非常顯著，溫度、裝料量和初始水分含量過高或過低都會使產(chǎn)香酵母J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的含量降低。當各因素大小從四周逐漸趨向中心點時，曲面圖呈凸起趨勢，說明相關(guān)因素交互作用越強，即菌株J7發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇能力趨向最大化，說明存在最大響應(yīng)值。運用Design-Expert 8.0.6軟件對結(jié)果進行分析，當預(yù)測的響應(yīng)值最大時，3個因素的最佳值為：溫度35.01 ℃，初始水分含量43.072%，裝料量70.22 g/250 mL，預(yù)測香味物質(zhì)苯乙醇的色譜峰峰面積為1.324×108?？紤]到實際情況，采用溫度為35 ℃，初始水分含量為43%，裝料量為70 g/250 mL進行驗證試驗，重復(fù)3次，結(jié)果顯示，發(fā)酵產(chǎn)物中大曲重要香味物質(zhì)苯乙醇的色譜峰面積平均值為1.332×108，與預(yù)測值1.324×108接近，證明擬合模型能較好的找出產(chǎn)香酵母J7的最佳發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇條件。

2.3 定量分析結(jié)果

以正丁醇為內(nèi)標物，對產(chǎn)香酵母J7在最優(yōu)條件下的發(fā)酵產(chǎn)物、優(yōu)質(zhì)濃香型大曲、小麥原料中的苯乙醇含量進行定量分析，測得苯乙醇在小麥原料、優(yōu)質(zhì)濃香型大曲、J7發(fā)酵產(chǎn)物中的含量分別為0.058、1.026、6.350 mg/100 g，三者的總離子流色譜見圖7至圖9。由圖7至圖9色譜峰可知，酵母J7發(fā)酵產(chǎn)物中，苯乙醇含量相較于小麥原料及優(yōu)質(zhì)濃香型大曲均有顯著的提高，相較于小麥原料其含量增長了108倍多，相較于優(yōu)質(zhì)濃香型大曲其含量增長了5倍多。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對傳統(tǒng)濃香型大曲中分離篩選的異常威克漢姆酵母J7的產(chǎn)香條件進行優(yōu)化，取得了良好效果：酵母J7在溫度為35 ℃，初始水分含量為43%，裝料量為70 g/250 mL的條件下進行固體小麥產(chǎn)香試驗，發(fā)酵9 d后苯乙醇色譜峰面積的平均值為1.332×108，與預(yù)測值較為接近。發(fā)酵產(chǎn)物中苯乙醇含量為6.350 mg/100 g，相較于優(yōu)質(zhì)濃香型大曲其含量增長了5倍多，相較于小麥原料其含量增長了108倍多。小麥培養(yǎng)基經(jīng)過淀粉酶及蛋白酶處理后接種產(chǎn)香異常威克漢姆酵母J7可用于濃香型白酒生產(chǎn)中香曲制備，也可采用現(xiàn)代分離技術(shù)從香曲中分離純化香味物質(zhì)苯乙醇，并應(yīng)用于白酒的勾兌調(diào)味或其他發(fā)酵食品。天然的苯乙香料添加劑越來越受到廣大消費者的歡迎，具有很好的開發(fā)前景，后續(xù)可對多菌共酵產(chǎn)生香味成分苯乙醇及其對于苯乙醇的生成與積累的影響進行研究。

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