蔣德菊 劉美霞 陳紹玲 李 康

深圳市龍崗中心醫(yī)院婦產(chǎn)科和中心實(shí)驗(yàn)室，深圳 518116

自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生≥2次稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)臨床較常見，近年來其發(fā)病有上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的身心健康，影響家庭幸福和社會(huì)健康發(fā)展，因此探求復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療和預(yù)防復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)有重要意義。本研究采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和正常早孕絨毛組織中MMP-9及TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，通過比較兩組MMP-9和TIMP-1的基因表達(dá)水平，探討MMP-9和TIMP-1動(dòng)態(tài)失衡與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，從分子水平研究復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對(duì)象為2013年4～12月在我院婦科門診就診患者，年齡 18～35 歲，月經(jīng)周期 5～7/28～30 d，停經(jīng)45～60 d，經(jīng)臨床婦科檢查、β-HCG和孕酮、彩超證實(shí)為宮內(nèi)妊娠，自愿選擇人工流產(chǎn)的宮內(nèi)妊娠活胎19例和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)28例（自然流產(chǎn)≥2次，各項(xiàng)檢查提示胚胎停育）。流產(chǎn)前兩組病史、年齡、孕產(chǎn)次、停經(jīng)天數(shù)均無(wú)明顯差異。

1.2 標(biāo)本采集

1.2.1 正常早孕組19例 彩超提示：宮內(nèi)單活胚。常規(guī)負(fù)壓吸宮術(shù)選取吸出物中的絨毛組織，液氮凍存。

1.2.2 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組28例 彩超提示：宮內(nèi)妊娠未見胎心，結(jié)合β-HCG和孕酮，確診為胚胎停育，行負(fù)壓吸宮術(shù)，留取絨毛組織液氮凍存。

1.3 研究方法

1.3.1 試劑 DNA Extraction kit （BioFlux），Taq polymerase（BioCer），Realtime PCR Master Mix（BioCer），Probe GAPDH（BioRad），Probe MMP9 和 TIMP1（BioRD）均購(gòu)于深圳市中生生物技術(shù)公司。

1.3.2 組織總RNA提取 ①取10～30mg組織塊，放入6mm陶瓷研缽中，加入液氮，剪成1 mm見方小塊，用陶瓷研磨杵充分研磨，直至成粉；②將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中，離心管中預(yù)先加入 600 μl Trizol溶液，充分顛倒混勻，室溫靜置5 min；③轉(zhuǎn)移上清液至吸附柱中，吸附柱套上新的離心管，12 000 r/min，離心30 s；④棄去外套管中液體，向吸附柱中加入600 μl洗脫液，12 000 r/min，離心 30 s；⑤重復(fù)步驟④一次；⑥棄去管中液體，空柱12 000 r/min，離心1 min；⑦將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的離心管，加入20 μl洗脫液，12 000 r/min，離心30 s。管中液體即為提取的總RNA溶液，立即用于下游實(shí)驗(yàn)或-80℃凍存。

1.3.3 目的基因和內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物特征 見表 1、圖 1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物特征（設(shè)計(jì)軟件PRIMER5）

圖1 目的基因擴(kuò)增曲線圖

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組MMP-9、TIMP-1基因平均CT值的比較

現(xiàn)在常用的兩種分析實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法是絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板的拷貝數(shù)；相對(duì)定量方法是比較經(jīng)過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異。2-ΔΔCT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡(jiǎn)便方法，即相對(duì)定量的一種簡(jiǎn)便方法。MMP-9平均CT值的差值=6.87-3.51=3.36，2-ΔΔCT=0.097，即復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組絨毛 MMP-9 mRNA 表達(dá)量相當(dāng)于正常早孕組的0.097倍；TIMP-1平均CT值的差值=8.74-12.14=-3.398，2-ΔΔCT=10.54，即復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組絨毛TIMP-1 mRNA表達(dá)量相當(dāng)于正常早孕組的 10.54 倍（表 2）。

表2 兩組MMP-9、TIMP-1基因平均CT值的比較

2.2 兩組mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組絨毛MMP-9 mRNA的平均表達(dá)量為 4.11±0.42，相當(dāng)于正常組絨毛的 0.097 倍（2-ΔΔCT=0.097，表2），較正常早孕組表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組絨毛TIMP-1平均表達(dá)量為7.62±1.54，相當(dāng)于正常早孕組絨毛的10.542倍（2-ΔΔCT=10.54，表 2），較正常早孕組表達(dá)升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.65）（表 3）。

表3 兩組mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表3 兩組mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

組別 n MMP-9 TIMP-1復(fù)發(fā)流產(chǎn)組正常早孕組t值P值28 19 4.11±0.42 2.45±0.36-2.80 0.01 7.62±1.54 8.41±1.02 0.45 0.65

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)在育齡婦女中的發(fā)生率約為1%[1]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)不僅給孕婦帶來心理創(chuàng)傷，甚至?xí)绊懙揭院蟮娜焉锝Y(jié)局[2]，可能導(dǎo)致日后不孕。約50%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因尚未明確[3]，滋養(yǎng)細(xì)胞具有高度增殖和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的潛能[4]，但在正常胚胎植入和胎盤形成時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞不會(huì)發(fā)生過度增殖，侵襲性生長(zhǎng)具有嚴(yán)格的時(shí)間性和空間性，限于孕早期及子宮壁的1/3處，提示機(jī)體可能通過細(xì)胞因子調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，使其保持動(dòng)態(tài)平衡。

細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是細(xì)胞之間的物質(zhì)，是由大分子構(gòu)成的錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，是阻止細(xì)胞浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的重要屏障[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解和再塑造細(xì)胞外基質(zhì)的Zn2+依賴性中性蛋白酶家族，對(duì)維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡起重要作用。MMPs組織抑制劑（TIMPs）可以阻斷體內(nèi)MMPs所起的作用，胚胎滋養(yǎng)層和蛻膜中均有MMPs和TIMPs表達(dá)，兩者間的平衡對(duì)于基質(zhì)的重建和侵襲程度的控制起重要作用。MMPs低表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足，影響胚胎的著床和正常生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致流產(chǎn)[6]。MMP-9是參與滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜的主要蛋白質(zhì)[7]。TIMP-1可以拮抗MMP-9，阻止子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)被MMP-9過度降解，阻止滋養(yǎng)層細(xì)胞的過度浸潤(rùn)[8-10]。但各學(xué)者研究結(jié)果不盡相同，Kuznetsova等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9水平表達(dá)低者流產(chǎn)的危險(xiǎn)性增加；Iwahashi等[12]研究提示，MMP-9通過分解Ⅳ型和Ⅴ型膠原參與流產(chǎn)過程；李萍[13]的研究認(rèn)為MMP-9在先兆流產(chǎn)蛻膜組織中表達(dá)高于正常早孕組。呂薈明等[14]研究認(rèn)為，TIMP-1 mRNA的表達(dá)量在流產(chǎn)組顯著降低。姜廣利等[15]研究認(rèn)為，正常早期妊娠的蛻膜和絨毛MMP-9和TIMP的平衡表達(dá)是維持正常早期妊娠的必要條件。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組絨毛MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較正常早孕組表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組絨毛 TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較正常早孕組表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組MMP-9表達(dá)量下降，TIMP-1較正常組表達(dá)升高，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足，胚胎著床過淺，胚胎血供營(yíng)養(yǎng)不足，影響胚胎正常生長(zhǎng)發(fā)育而致流產(chǎn)，MMP-9和TIMP-1的動(dòng)態(tài)失衡參與了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生、發(fā)展，與大部分學(xué)者的研究結(jié)果基本一致，為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的婦女藥物阻斷MMP-9和TIMP-1的失衡，提高妊娠成功率提供了理論依據(jù)和新思路。然而兩者對(duì)生殖過程各環(huán)節(jié)的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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