朱文祥，謝學(xué)輝，馮 帆，柳建設(shè)

(東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620)

茚三酮定量蛋白質(zhì)方法的改進(jìn)

朱文祥，謝學(xué)輝，馮 帆，柳建設(shè)

(東華大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201620)

首次結(jié)合高溫堿裂解和乙二醇體系反應(yīng)液的優(yōu)勢(shì)，對(duì)茚三酮定量蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行了改進(jìn)，同時(shí)對(duì)測(cè)量過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定了測(cè)量波長(zhǎng)為570nm、裂解時(shí)間為15min、顯色時(shí)間為15min和冷卻時(shí)間為5min.在該改進(jìn)方法條件下，以BSA(牛血清白蛋白)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，驗(yàn)證了該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性.將該方法與茚三酮直接測(cè)定法和考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行比較，結(jié)果表明其具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景.

茚三酮；堿裂解；乙二醇；考馬斯亮藍(lán)

蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量是生物、醫(yī)學(xué)、食品、法醫(yī)、環(huán)境等領(lǐng)域的常見(jiàn)問(wèn)題[1].蛋白質(zhì)定量法主要有凱氏定氮法、紫外吸收法、Lowry法、BCA(bicinchoninic acid)法，這些方法都具有操作過(guò)程復(fù)雜、影響因素較多、準(zhǔn)確性和靈敏度較低等缺陷[2].考馬斯亮藍(lán)染色法操作簡(jiǎn)便，受到廣大科研工作者的親睞[3]，但該法靈敏度低、準(zhǔn)確性較差[3-5].因此，尋找一種靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)定量法迫在眉睫.

茚三酮在酸性的還原性環(huán)境下能與氨基酸、蛋白質(zhì)中的α-氨基迅速反應(yīng)，產(chǎn)物羅曼紫(Ruhemann’s purple)在波長(zhǎng)560～580nm有吸收峰[6].該方法被廣泛應(yīng)用于食品、法醫(yī)、臨床診斷等領(lǐng)域中氨基酸和蛋白質(zhì)的定性或定量檢測(cè)[7-9]，其反應(yīng)機(jī)理如圖1所示.文獻(xiàn)[1]報(bào)道茚三酮與氨基酸反應(yīng)的靈敏度比與蛋白質(zhì)反應(yīng)高40倍，這是因?yàn)橄嗤|(zhì)量下，氨基酸中所含α-氨基的數(shù)量要遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)中的數(shù)量.因此，通過(guò)茚三酮定量氨基酸來(lái)間接定量蛋白質(zhì)含量，其靈敏度和準(zhǔn)確度更有保障.

圖1 茚三酮與氨基酸反應(yīng)機(jī)理[6]Fig.1 Mechanism of reaction between ninhydrin and animo acids [6]

因此，將蛋白質(zhì)完全裂解成氨基酸后再用茚三酮定量氨基酸是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)準(zhǔn)確定量的新途徑[10].而尋找合適的裂解方式和穩(wěn)定的茚三酮反應(yīng)液是實(shí)現(xiàn)茚三酮準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)首要解決的兩大難題.目前，茚三酮定量蛋白質(zhì)法中采用兩類蛋白質(zhì)裂解方法，即高溫酸裂解法[5,11-13]和高溫堿裂解法[10,14-15].高溫酸裂解法一般耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)4～24h，相比之下，高溫堿裂解法耗時(shí)短，裂解效率高，可在0.5h內(nèi)將蛋白質(zhì)完全裂解，并能消除樣品中胺類、核酸等物質(zhì)對(duì)茚三酮反應(yīng)的影響[10,14-15]，故高溫堿裂解法更有優(yōu)越性.茚三酮反應(yīng)液的穩(wěn)定性決定定量的準(zhǔn)確性[16].以醋酸纖維素、二甲基亞砜、乙醇、丙酮等為溶劑的反應(yīng)液均有報(bào)道，但其穩(wěn)定性差，配制過(guò)程復(fù)雜，需現(xiàn)配現(xiàn)用[17]，極大限制了茚三酮在定量氨基酸和蛋白質(zhì)的應(yīng)用.文獻(xiàn)[5]的研究發(fā)現(xiàn)，相比廣泛使用的醋酸纖維素和二甲基亞砜，以毒性更低的乙二醇為溶劑能明顯提高顯色液的穩(wěn)定性，能在一個(gè)月內(nèi)保持測(cè)量的準(zhǔn)確性，此外，在配制和保存過(guò)程中無(wú)需氮?dú)猸h(huán)境，更為簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì).

鑒于以上分析，采用高溫堿裂解法裂解蛋白質(zhì)，然后以乙二醇為溶劑的反應(yīng)液定量裂解后的氨基酸，這可能是實(shí)現(xiàn)茚三酮法準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)的有效途徑.目前，此方面的研究未見(jiàn)報(bào)道.因此，本文結(jié)合高溫堿裂解法和乙二醇溶劑下的茚三酮反應(yīng)液的優(yōu)勢(shì)，建立改進(jìn)的茚三酮定量蛋白質(zhì)的方法，在優(yōu)化測(cè)量參數(shù)的基礎(chǔ)上，研究了該改進(jìn)方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和靈敏性.最后通過(guò)與直接茚三酮測(cè)定法和考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)比，驗(yàn)證了本文改進(jìn)方法是一種更為實(shí)用、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)定量方法.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氫氧化鈉(國(guó)藥集團(tuán)，上海)；茚三酮(Sigma-aldrich，美國(guó))；考馬斯亮藍(lán)定量試劑盒(上海生工生物工程有限公司，上海)；微量紫外分光光度計(jì)(Implen公司，德國(guó))；高壓滅菌鍋(上海申安儀器有限公司，上海).其他試劑均為分析純.

1.2 蛋白質(zhì)高溫裂解

將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液分裝在2 mL離心管中，烘箱中105℃烘干2 h左右.取出后向每只離心管中加入500μL 13.5mol/L的NaOH裂解液，蓋緊離心管管蓋，在漩渦混合器上輕輕混勻后將其放入高壓滅菌鍋高溫裂解.為防止離心管管蓋在高溫高壓環(huán)境下開(kāi)裂，可用封口膜以橡皮筋固定離心管管蓋.

1.3 茚三酮反應(yīng)液的配制

參照文獻(xiàn)[5]配制茚三酮反應(yīng)液.

1.4 測(cè)定流程

取100μL上述蛋白質(zhì)裂解液，加入170μL冰醋酸，輕微振蕩混勻后，加入200μL茚三酮反應(yīng)液，在沸水浴中加熱后室溫下冷卻，取250μL產(chǎn)物加到750μL的50%異丙醇溶液中，在旋渦混合器上劇烈振蕩30s后，由微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值.

1.5 最佳測(cè)量條件的優(yōu)化

最佳測(cè)量波長(zhǎng)：茚三酮與含有α-氨基的物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成產(chǎn)物在波長(zhǎng)560～580nm內(nèi)有特征吸收峰.但據(jù)相關(guān)報(bào)道，在不同反應(yīng)條件下產(chǎn)物的最佳吸收波長(zhǎng)可為480[18]，565[19]，568[8,20]，570[21]，575nm[5-6].為確定在本文所改進(jìn)方法下反應(yīng)產(chǎn)物的最佳測(cè)量波長(zhǎng)，將牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)高溫高壓堿裂解，并與茚三酮進(jìn)行顯色反應(yīng)，將產(chǎn)物在波長(zhǎng)450～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描.

最佳裂解時(shí)間：裂解時(shí)間的長(zhǎng)短直接決定蛋白質(zhì)是否完全裂解成游離氨基酸.在裝有蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的離心管烘干后加入500μL 13.5mol/L的NaOH裂解液，在高壓滅菌鍋中分別裂解5,10,15,20min，以未加蛋白質(zhì)的裂解液作空白對(duì)照，每組做4個(gè)平行試驗(yàn).

最佳顯色時(shí)間：茚三酮與氨基酸反應(yīng)過(guò)程中，顯色時(shí)間是決定產(chǎn)物生成量的關(guān)鍵因素.在含有蛋白質(zhì)裂解液的離心管中加入200μL茚三酮反應(yīng)液，沸水浴中分別加熱5,10,15,20,25min，以未加蛋白質(zhì)的裂解液作為空白對(duì)照，每組做4個(gè)平行試驗(yàn).

最佳冷卻時(shí)間：在沸水浴中生成的反應(yīng)產(chǎn)物需經(jīng)一定時(shí)間冷卻才能準(zhǔn)確測(cè)量.將裝有反應(yīng)產(chǎn)物的離心管放在室溫下分別冷卻0,5,10,15,20min后測(cè)量，以未加蛋白質(zhì)的裂解液作為空白對(duì)照，每組做4個(gè)平行試驗(yàn).

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及其重復(fù)性檢驗(yàn)

按照所述的測(cè)定流程，分別取含BSA為2,4,6,8,10,20,30,40μg的裂解液與茚三酮反應(yīng)液反應(yīng)，以未加蛋白質(zhì)的PBS(磷酸鹽)緩沖液為空白對(duì)照，每組做4個(gè)平行試驗(yàn)，制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線.72 h后再次取含BSA為6和8μg的裂解液與上述茚三酮反應(yīng)液反應(yīng)，檢驗(yàn)該法的重復(fù)性和茚三酮反應(yīng)液的穩(wěn)定性.

1.7 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

本文采用精密度和蛋白質(zhì)的回收率兩個(gè)指標(biāo)來(lái)表征所述方法的穩(wěn)定性.精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)表示，在空白加標(biāo)試驗(yàn)條件下計(jì)算蛋白質(zhì)的回收率.此外，為探究在高溫高壓強(qiáng)堿性環(huán)境下氨基酸結(jié)構(gòu)是否遭到破壞，以氨基酸中結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的甘氨酸為例，通過(guò)本改進(jìn)方法和本改進(jìn)方法中省去高溫高壓堿裂解步驟的相對(duì)比進(jìn)行論證.

1.8 靈敏度與準(zhǔn)確性分析

采用本文所建立的改進(jìn)方法，取含BSA、明膠、蛋白酶K和溶菌酶(2,4,6,8,10μg)的裂解液，按照上述測(cè)定流程制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線.茚三酮直接測(cè)定法省去高溫堿裂解步驟，其他步驟與本改進(jìn)方法一致.考馬斯亮藍(lán)染色法按照經(jīng)典的測(cè)定流程，分別取含有蛋白質(zhì)量為2,4,6,8,10μg的PBS緩沖液100μL，再加入考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)液1mL，5min 后測(cè)定波長(zhǎng)595nm處的吸光度值，制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳測(cè)量條件優(yōu)化結(jié)果

將反應(yīng)產(chǎn)物在波長(zhǎng)450～700nm內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖2(a)所示.由圖2(a)可知，產(chǎn)物在波長(zhǎng)570nm 處有最大特征吸收峰.

將BSA標(biāo)準(zhǔn)液在滅菌鍋中高溫堿裂解，其產(chǎn)物吸光度隨裂解時(shí)間的變化如圖2(b)所示.結(jié)果表明裂解15min可使蛋白質(zhì)完全裂解為游離氨基酸.

將蛋白質(zhì)裂解液與茚三酮反應(yīng)液混合后在沸水浴中進(jìn)行顯色反應(yīng)，產(chǎn)物吸光度隨加熱時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖2(c)所示.由圖2(c)可知，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物的吸光度變化不大，說(shuō)明該顯色反應(yīng)迅速、靈敏、穩(wěn)定，顯色15min后可使游離氨基酸與茚三酮完全反應(yīng)，之后出現(xiàn)略微下降，這是由于羅曼紫降解所致.

將反應(yīng)產(chǎn)物在室溫下冷卻不同時(shí)間后再測(cè)量其吸光度值，結(jié)果如圖2(d)所示.由圖2(d)可知，產(chǎn)物不經(jīng)冷卻會(huì)導(dǎo)致吸光度測(cè)量值偏低，冷卻不少于5min后吸光度值保持恒定，同時(shí)說(shuō)明羅曼紫在50%異丙醇溶液中能較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在.

綜上分析可知，測(cè)量波長(zhǎng)為570nm、高溫裂解時(shí)間為15min、顯色時(shí)間為15min、冷卻時(shí)間為5min 為該改進(jìn)的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法的最佳測(cè)量條件.

圖2 改進(jìn)的茚三酮法參數(shù)優(yōu)化圖Fig.2 The parameters optimization of the improved ninhydrin assay

2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線及重復(fù)性檢驗(yàn)

以該改進(jìn)的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法測(cè)定的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示.在蛋白質(zhì)量為2～40μg時(shí)，蛋白質(zhì)量與吸光度值具有很好的線性關(guān)系(R2=0.996，RSD<0.6)，說(shuō)明該改進(jìn)的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法能準(zhǔn)確測(cè)量該范圍的蛋白質(zhì)，并且在蛋白質(zhì)量?jī)H為40μg時(shí)，吸光度值已接近2.5，反應(yīng)現(xiàn)象明顯，從側(cè)面反映該方法的靈敏度極高.在低蛋白質(zhì)量范圍內(nèi)(2～10μg)，線性關(guān)系方程式為y=0.07x-0.0216，R2=0.998，RSD<0.04，表明該方法在定量極微量蛋白質(zhì)時(shí)具有更大優(yōu)勢(shì).72 h后再以含BSA為6和8μg的裂解液與上述茚三酮反應(yīng)液反應(yīng)，結(jié)果表明該改進(jìn)方法的重復(fù)性高，同時(shí)說(shuō)明該茚三酮反應(yīng)液穩(wěn)定性好，增強(qiáng)了以茚三酮定量蛋白質(zhì)方法的實(shí)用性.

圖3 牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線及重復(fù)性檢驗(yàn)Fig.3 The standard curve of bovine serum albumin (BSA) and repeatability test

2.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

蛋白質(zhì)的回收率試驗(yàn)結(jié)果如表1所示.由表1可知，本改進(jìn)方法在測(cè)定時(shí)數(shù)據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%，蛋白質(zhì)回收率接近100%，說(shuō)明該方法在測(cè)量時(shí)的穩(wěn)定性及精密度好.

表1 回收率試驗(yàn)Table 1 Recovery experiments

甘氨酸對(duì)比試驗(yàn)如表2所示.由表2可知，在短時(shí)間內(nèi)，蛋白質(zhì)在高溫高壓強(qiáng)堿性環(huán)境下裂解與未經(jīng)高溫高壓堿裂解對(duì)比，可以發(fā)現(xiàn)其裂解液的吸光度未有明顯改變，說(shuō)明氨基酸中的氨基結(jié)構(gòu)未遭到破壞.由此可知，蛋白質(zhì)經(jīng)高溫高壓堿裂解后所釋放的游離氨基酸在此條件下依然能保持α-氨基結(jié)構(gòu)的完整性，從而保證了該方法在蛋白質(zhì)定量過(guò)程中的穩(wěn)定性.

表2 甘氨酸在高溫高壓強(qiáng)堿性水解液中的穩(wěn)定性Table 2 Stability of glycine in alkaline hydrolysis with high pressure and temperature

2.4 靈敏度與準(zhǔn)確性分析

分別取BSA、溶菌酶(Lysozyme)、蛋白酶K(Proteinase K)和明膠(Geltin)，以本文改進(jìn)的茚三酮法(IN)、茚三酮直接測(cè)定法(DN)和考馬斯亮藍(lán)染色法(CBB)做對(duì)比試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.本文改進(jìn)的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法在測(cè)定2～10μg蛋白質(zhì)的吸光度均較大，說(shuō)明該法靈敏度高；且相同質(zhì)量不同種類蛋白質(zhì)的吸光度相近，說(shuō)明該方法在蛋白質(zhì)定量時(shí)只與蛋白質(zhì)量有關(guān)，與種類基本無(wú)關(guān)；不同蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性程度高(R2≥0.998)，線性直線近乎重疊，進(jìn)一步說(shuō)明該方法在測(cè)量蛋白質(zhì)時(shí)準(zhǔn)確性好.而茚三酮直接測(cè)定法在蛋白質(zhì)量2～10μg 內(nèi)無(wú)法檢測(cè)到BSA、溶菌酶和明膠，說(shuō)明茚三酮直接測(cè)定法的靈敏度極低，無(wú)法實(shí)現(xiàn)低濃度蛋白質(zhì)的定性和定量，但在定量蛋白酶K時(shí)吸光度較大，這很可能是由于該蛋白質(zhì)裸露的α-氨基含量明顯高于其他3種蛋白質(zhì).相比于其他兩種定量蛋白質(zhì)方法，考馬斯亮藍(lán)染色法顯示不同種類蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性程度波動(dòng)大(R2=0.951～0.998)，表明該方法的靈敏度與準(zhǔn)確性均較差.

通過(guò)上述對(duì)比分析可知，采用本文所述改進(jìn)的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法，其準(zhǔn)確性與靈敏度明顯優(yōu)于茚三酮直接測(cè)定法和考馬斯亮藍(lán)染色法.

圖4 相同質(zhì)量不同種類蛋白質(zhì)分別采用改進(jìn)的茚三酮法、茚三酮直接測(cè)定法與考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定比較Fig.4 Comparison of four kinds of proteins measured by IN assay,DN assay and CBB assay

3 結(jié) 語(yǔ)

(1) 本文首次結(jié)合高溫堿裂解和以乙二醇為溶劑的反應(yīng)液的優(yōu)勢(shì)，對(duì)茚三酮定量蛋白質(zhì)法進(jìn)行改進(jìn)研究.采用該方法對(duì)茚三酮測(cè)定蛋白質(zhì)含量反應(yīng)過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研究，確定了相關(guān)最佳參數(shù)：測(cè)量波長(zhǎng)為570nm、裂解時(shí)間為15min、顯色時(shí)間為15min和冷卻時(shí)間為5min.

(2) 基于該改進(jìn)的茚三酮定量蛋白質(zhì)方法，用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在蛋白質(zhì)量?jī)H為2～40μg即能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量，并在低蛋白質(zhì)量范圍內(nèi)(2～10μg)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.07x-0.0216(R2=0.998，RSD<0.04).蛋白質(zhì)回收率試驗(yàn)表明測(cè)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.01%～3.39%和蛋白質(zhì)回收率為97.4%～100.5%，同時(shí)以甘氨酸為對(duì)象論證了該改進(jìn)方法中的高溫高壓堿裂解在短時(shí)間內(nèi)對(duì)氨基酸中氨基結(jié)構(gòu)無(wú)影響.由此證明該方法在測(cè)定過(guò)程中具有較高重復(fù)性和穩(wěn)定性.

(3) 本文改進(jìn)的茚三酮定量蛋白質(zhì)法，利用了茚三酮與氨基酸中氨基的高度靈敏反應(yīng)，雖在操作過(guò)程中將目標(biāo)產(chǎn)物稀釋近8倍，但還能準(zhǔn)確定量到2 μg蛋白質(zhì)，說(shuō)明該方法在定量極微量蛋白質(zhì)上具有更大潛力，且不同種類蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性程度高，且曲線近乎重合，從而說(shuō)明本方法的靈敏性、準(zhǔn)確度和適用性高.通過(guò)與茚三酮直接測(cè)定法和考馬斯亮藍(lán)染色法比較可知，本文改進(jìn)的方法是一種更為靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)定量方法，在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景.

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Improvement of Protein Determination by Ninhydrin Assay

ZHUWen-xiang,XIEXue-hui,FENGFan,LIUJian-she

(School of Environmental Science and Engineering,Donghua University,Shanghai 201620,China)

Alkaline hydrolyzed proteins in high temperature and ninhydrin reagent prepared in the ethylene glycol dissolving system were first combined with respective advantage.Several key parameters including measure wavelength,hydrolyzing time,colouration time and cooling time were optimized,which were 570nm,15min,15min and 5min,respectively.The high repeatability and stability of this Improved Ninhydrin (IN) assay was testified by the standard curve of BSA (Bovine Serum Albumin).Futhermore,it reveals that IN assay shows higher linear and sensitivity than Direct Ninhydrin and Coomassie Brilliant Blue assay.Therefore,the IN assay has great application prospects in the field of biology,chemistry and medicine owing to its sensitivity,accuracy and stability for determination of a variety of proteins.

ninhydrin; alkaline hydrolysis; ethylene glycol; Coomassie Brilliant Blue

1671-0444(2015)01-0060-05

2013-10-11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41073060);教育部博士點(diǎn)新教師基金資助項(xiàng)目(20120075120014);上海市自然科學(xué)基金青年資助項(xiàng)目(12ZR1440400);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目(B604)

朱文祥(1989—)，男，江西鷹潭人，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境生物技術(shù).E-mail:zhuwenxiang2011@126.com柳建設(shè)(聯(lián)系人),男,教授,E-mail:liujianshe@dhu.edu.cn

Q 5-33；Q 530

A