張 雪，陳格飛，孟 清

(東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620)

大腹園蛛主壺腹腺絲基因的篩選及序列分析

張 雪，陳格飛，孟 清

(東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620)

為研究蛛絲蛋白編碼基因和蛋白的組成結(jié)構(gòu)模式、進化，并為蛛絲仿生提供更多的基因資源，運用3D/PCR(three -dimensional polymerase chain reaction)技術(shù)對大腹園蛛(A.ventricosus)Fosmid基因組文庫進行主壺腹腺絲(MaSp1)編碼基因的篩選，并對部分序列進行分析.通過篩選實驗室前期構(gòu)建的Fosmid文庫獲得含有MaSp1基因的陽性克隆Av11-19-5，通過shotgun測序得到MaSp1部分基因序列MaSp1RC.MaSp1RC長786 bp，編碼的262個氨基酸(AvMaSp1RC)可劃分為保守的 C端非重復(fù)區(qū)(CT)和重復(fù)區(qū)(Rep).Rep主要由poly-Ala，Glyx和GlyGlyx等模塊組成，Ala和Gly含量占總氨基酸的78%；CT中參與形成離子鍵的氨基酸及helix 4上的疏水模塊高度保守.研究結(jié)果為蛛絲蛋白二聚化及仿生學(xué)研究提供了更多的基因資源.

大腹園蛛；主壺腹腺絲蛋白；3D/PCR技術(shù)；序列分析

蜘蛛絲(spider silk)是一種生物可降解的高分子蛋白纖維，其理化性質(zhì)及力學(xué)性能均優(yōu)于現(xiàn)有的人造合成材料，因而，其在國防、軍事、建筑、醫(yī)療和紡織等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，成為仿生學(xué)研究的重要目標(biāo)[1-5].圓網(wǎng)蛛可分泌6種絲纖維和一種黏液蛋白，分別扮演不同的生物學(xué)角色，如捕捉和黏合獵物、編織卵袋、固定連接等[6].主壺腹腺分泌的主壺腹腺絲(MaSp)構(gòu)成整個蛛網(wǎng)的主干，以其高強度和高彈性而備受關(guān)注.20世紀(jì)90年代，國內(nèi)外學(xué)者開始蛛絲蛋白基因的克隆研究，但至今蛛絲基因及蛋白序列的結(jié)構(gòu)模式還沒有解析完全[7-8].文獻(xiàn)[9]證實Nephilaclavipes和Nephilamadagascariensis鞭毛狀絲蛋白(Flagelliform，F(xiàn)lag)編碼基因中含有13個大小均勻的內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄子大小約為15.5kb；文獻(xiàn)[10]報道了Argiopetrifasciata(A.trifasciata)主壺腹腺絲(major ampullate spidroin，MaSp)蛋白2亞基部分基因序列，與Flag編碼基因結(jié)構(gòu)相似，A.trifasciataMaSp2也含有多個大小一致的內(nèi)含子.文獻(xiàn)[11]報道了Latrodectushesperus(L.hesperus)MaSp1/2全長編碼基因序列，證實L.hesperusMaSp1/2編碼基因均由一個較為罕見的開放閱讀框架組成，MaSp1/2基因大小分別約為11和10kb.文獻(xiàn)[12]報道了大腹園蛛(Araneusventricosus，A.ventricosus)次壺腹腺絲(minor ampullate spidroin，MiSp)蛋白全長編碼基因，該基因與文獻(xiàn)[9-11]的基因模式均不相同，含有一個5.6 kb的基因內(nèi)含子.文獻(xiàn)[13]證實L.hesperus葡萄狀絲(Aciniform spidroin，AcSp)全長編碼基因序列只含有一個19 kb的開放閱讀框架.另外，文獻(xiàn)[14]通過PCR( polymerase chain reaction)的方法初步確定Argiopeargentata(A.argentata)和L.hesperus管狀絲蛋白(Tubuliform spidroin，TuSp)編碼基因不含有基因內(nèi)含子.上述基因結(jié)構(gòu)模式表明蛛絲蛋白編碼基因具有進化多樣性，但迄今為止，僅有3條全長基因序列：L.hesperusMaSp1/2、A.ventricosusMiSp和L.hesperusAcSp[11-13]，還不足以對蛛絲蛋白編碼基因及蛋白的結(jié)構(gòu)模式進行系統(tǒng)性分析.另外，蛛絲基因的克隆進展緩慢，嚴(yán)重阻礙了蛛絲仿生的研究，現(xiàn)階段，蛛絲蛋白的表達(dá)主要為蛛絲模塊的串聯(lián)體，仿生的擬蛛絲纖維性能遠(yuǎn)不及天然蛛絲.

大腹園蛛為蛛形綱蜘蛛目園蛛屬節(jié)肢動物，網(wǎng)較大且絲性能突出，在我國分布廣泛.為進一步研究蛛絲蛋白編碼基因和蛋白的組成結(jié)構(gòu)模式，并為仿生學(xué)提供更多的基因資源，本文以前期構(gòu)建的無偏向性、覆蓋倍數(shù)高的A.ventricosusFosmid 基因組文庫為基礎(chǔ)[15]，利用3D/PCR(three-dimensional polymerase chain reaction)篩選方法對文庫進行MaSp1編碼基因的篩選，得到含有MaSp1編碼基因的陽性克隆，并進行shotgun測序，從而對獲取的部分MaSp1序列進行分析和討論.

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

A.ventricosus采集于上海松江周邊地區(qū)，液氮速凍后-80℃保存；大腹園蛛基因組文庫由實驗室保存；Taq DNA 聚合酶(Vazyme公司，美國)；QIprepTMSpin Miniprep Kit(Qiagen,德國)；AxyprepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen,美國)；CopyControlTMHTP Fosmid Library Production Kit(Epicentre，美國).

1.2 方法

(1) 引物的設(shè)計.根據(jù)NCBI(national center for biotechnology information)Genbank收錄的有關(guān)蜘蛛MaSp的C端氨基酸序列Blast分析，確定MaSp的C端非重復(fù)區(qū)(CT)保守氨基酸序列，設(shè)計引物(如表1所示)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(簡稱上海生工)測序合成.

表1 引物序列Table 1 Primers

(2)A.ventricosus基因組的提取及標(biāo)簽序列的獲取.以A.ventricosus胸部肌肉組織為原料，采用改良CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide)法提取高相對分子質(zhì)量基因組DNA(high molecular weight genome DNA,HMW-gDNA)[16]，以引物MaSp-up和MaSp-down對基因組DNA進行擴增，循環(huán)條件為95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，65℃ 退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)數(shù)為30，終始延伸10min.對目的條帶進行切膠回收，送上海生工測序.經(jīng)過條件優(yōu)化得到257 bp的DNA片段，測序后進行NCBI BlastN 同源序列比對確定此序列為A.ventricosusMaSp C端非重復(fù)區(qū)部分序列，并確定該序列為標(biāo)簽序列進行文庫篩選.

(3) 文庫的篩選.采用3D/PCR法篩選A.ventricosusFosmid基因組文庫:①超級混合池(混合池的構(gòu)建詳見文獻(xiàn)[15])的菌種接種于5mL含12.5μg/mL氯霉素的LB( Luria-Bertani)培養(yǎng)基中，37℃，180r/min過夜培養(yǎng)，提取混合質(zhì)粒進行PCR篩選，對目的條帶切膠回收測序，以確定其中是否存在一個或多個陽性克?。虎诖_定超級混合池的混合質(zhì)粒中存在的陽性克隆后，抽提一級混合池和二級混合池質(zhì)粒，分別進行PCR篩選；③陽性克隆存在的批次通過超級混合池的篩選來確定，陽性克隆存在的384-well plates的編號由一級混合池可以確定，陽性克隆存在的行列交叉位置根據(jù)二級混合池篩選確定，由此確定陽性克隆的具體位置.用引物MaSp-repeat和MaSp-down進一步驗證陽性克隆.

(4) Fosmid陽性單克隆高拷貝誘導(dǎo)及末端測序鑒定.在15mL試管中加入4.5mL新鮮LB培養(yǎng)基(含12.5μg/mL氯霉素)、500μL過夜活化菌液和5μL Copycontrol Induction Solution，配成理想的誘導(dǎo)體系，37 ℃，180r/min振蕩培養(yǎng)5h，誘導(dǎo)Fosmid陽性單克隆質(zhì)粒的高拷貝，整個過程需保證通氣性良好，抽提重組pCC2FOSTM載體.將提取高拷貝單克隆pCC2FOSTM重組載體，以End-F和End-R為引物，送上海生工對陽性克隆進行Fosmid末端測序.

(5) 序列分析.通過末端測序鑒定插入目的片段的完整性，對包含目的基因的陽性克隆送上海生工進行shotgun測序.利用DNAman、SerialCloner 2-6-1、Clustal Omega、PSIPRED v3.3(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)以及MEGA 4.0對當(dāng)前已獲取的部分序列進行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組提取、PCR擴增及陽性克隆的篩選鑒定

利用改良CTAB法提取A.ventricosus基因組DNA(如圖1(a)所示)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，基因組DNA彌散性小，大片段較為集中.以基因組DNA為模板,MaSp-up和MaSp-down為引物進行MaSp C端蛋白基因PCR擴增，經(jīng)過優(yōu)化PCR條件和體系，得到特異性高的PCR產(chǎn)物(如圖1(b)所示)，位于200～300bp.回收該片段進行測序分析，測序結(jié)果經(jīng)比對證實為A.ventricosusMaSp1C端基因序列.以該片段作為MaSp1編碼基因的標(biāo)簽序列對文庫進行篩選，如圖1(c)所示，在11號超級混合池中篩選得到陽性條帶，并通過進一步篩選相應(yīng)的一級/二級混合池得到陽性克隆Av11-19-5，約為40kb.Av11-19-5經(jīng)Fosmid末端引物測序分析確定該克隆含有A.ventricosusMaSp1編碼基因.

圖1 大腹園蛛基因組、PCR以及文庫篩選凝膠圖譜Fig.1 Agarose gel figures of A.ventricosus genome，PCR and library screening

2.2 AvMaSp1RC氨基酸序列分析

對陽性克隆Av11-19-5進行shotgun測序得到多個MaSp1片段，將包含部分重復(fù)區(qū)和C端非重復(fù)區(qū)的片段命名為MaSp1RC.MaSp1RC長786 bp，預(yù)編碼262個氨基酸(AvMaSp1RC).AvMaSp1RC可劃分為重復(fù)區(qū)(Rep)和C端非重復(fù)區(qū)(CT，110個氨基酸殘基)(圖2).AvMaSp1RC重復(fù)區(qū)主要由甘氨酸(Glycine，Gly)和丙氨酸(Alanine，Ala)組成，約占總氨基酸含量的78%(如圖3(a)所示)，主要以GlyGlyx，Glyx(x為其他氨基酸)和poly-Ala典型的蛛絲蛋白模塊形式存在.AvMaSp1RC非重復(fù)區(qū)絲氨酸(Serine，Ser)、Ala和纈氨酸(Valine，Val)、亮氨酸(Leucine,Leu)(大約占67%,如圖3(b)所示)含量較高.對AvMaSp1RC中含量相對較高的4種氨基酸(Ala，Ser，Gly，Gln)進行密碼子偏愛性分析，結(jié)果如圖4所示.由圖4可以看出，密碼子第三位腺嘌呤(Adenine，A)和胸腺嘧啶(Thymine，T)占主要優(yōu)勢，鳥嘌呤(Guanine，G)和胞嘧啶(Cytosine，C)使用頻率較低.

利用PSIPRED對AvMaSp1RC CT二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，AvMaSp1RC CT主要由5個α-helix組成(圖2)，其中最長的helix 4呈現(xiàn)高疏水性(圖5，氨基酸位置為213～233).AvMaSp1RC重復(fù)區(qū)由于重復(fù)性高，親疏水性呈周期性變化，分布均勻.

圖2 MaSp1RC序列及編碼氨基酸Fig.2 MaSp1RC gene sequence and amino acids

圖3 AvMaSp1RC重復(fù)區(qū)和非重復(fù)CT氨基酸組成分析Fig.3 Amino acid composition of AvMaSp1RC Rep and CT domains

圖4 AvMaSp1RC高頻氨基酸密碼子偏愛性分析Fig.4 Codon preference of high-frequency amino acids predicted from AvMaSp1RC

圖5 AvMaSp1RC親疏水性分析Fig.5 Kyte -Doolittle hydrophobicity plot for AvMaSp1RC

2.3 AvMaSp1同源性分析

利用Clustal Omega對AvMaSp1RC與NCBI收錄的其他多種蛛絲蛋白C端序列進行序列比對分析，結(jié)果如圖6所示.由圖6可以看出，AvMaSp1RC與其他的蛛絲蛋白C端氨基酸序列保守性較高，其中精氨酸(Arginine，Arg)、天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)、谷氨酸(Glutamic acid，Glu)以及賴氨酸(Lysine，Lys)呈高保守(圖6中矩形框).另外，MiSp和MaSp的CT結(jié)構(gòu)域中QALL模塊以及MaSp的CT中的半胱氨酸(Cysteine，Cys)也高度保守.

圖6 AvMaSp1RC CT與NCBI收錄的多條蛛絲蛋白C端序列比對Fig.6 Amino acid alignment of AvMaSp1RC CT with different spidroin CT domains deposited in NCBI

圖7 AvMaSp1RC系統(tǒng)進化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of AvMaSp1RC

利用NCBI中的Protein Blast對C端序列進行同源性分析，結(jié)果顯示AvMaSp1RC CT與多條MaSp CT序列具有較高的一致性，其中與Argiopeamoena(A.amoena)MaSp1CT一致性高達(dá)92%，與A.trifasciataMaSp1CT一致性達(dá)85%，與Argiopebruennichi(A.bruennichi)的一致性也高達(dá)83%，除此之外，還與其他數(shù)種蜘蛛絲的相似性達(dá)70%以上.利用MEGA V4.0對NCBI上選取的多種蛛絲蛋白C端氨基酸序列(A.trifasciataMaSp2，A.bruennichiMaSp1，N.clavipesFlag，L.hesperusMiSp，U.diversusMiSp，L.hesperusAcSp1，A.ventricosusAcSp，A.argentataTuSp1，A.apertaTuSp1，A.gulosusfibroin1，P.tristisfibroin1，A.trifasciataPySp，L.hesperusPySp.)繪制同源蛋白進化樹，結(jié)果如圖7所示.由圖7可以看出，AvMaSp1RC與A.trifasciataMaSp2，A.bruennichiMaSp1位于同一節(jié)點，屬于同一個基因家族，與Flag,AcSp,TuSp和PySp屬于不同的基因家族.

3 討 論

蛛絲纖維由高相對分子質(zhì)量的蛛絲蛋白組成，如主壺腹腺絲主要由MaSp1和MaSp2兩個亞基組成，鞭毛狀絲則由Flag單個亞基組成，次壺腹腺絲由MiSp1和MiSp2組成等[7-9,11,17].雖然蛛絲蛋白組成成分各不相同，但初級結(jié)構(gòu)較為相似，均由N端和C端非重復(fù)區(qū)以及重復(fù)區(qū)組成，其中NT和CT可調(diào)節(jié)蛛絲蛋白的纖維化，而Rep則與絲纖維的性能相關(guān)[11-13,18-20].組成MaSp，MiSp以及Flag Rep的主要模塊為polyA/GA，GGx，GPGGx/GPGQQ以及Spacer.polyA/GA可形成緊密的β-sheet晶體結(jié)構(gòu)，與纖維軸向平行，賦予纖維強度；GPGGx/GPGQQ形成β-spiral結(jié)構(gòu)，與纖維良好的延展性相關(guān)；GGx模塊則主要形成31-helix，連接晶態(tài)區(qū)域；Spacer功能尚不明確[12,13,21-24].主壺腹腺絲蛋白主要由polyA，GGx和GPGQQ組成，次壺腹腺則主要由polyA/GA，GGx及Spacer組成，由于GA形成的β-sheet晶體結(jié)構(gòu)不如polyA形成的β-sheet晶體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因此次壺腹腺絲較主壺腹腺絲強度弱[22].鞭毛狀絲蛋白不含polyA，力學(xué)強度遠(yuǎn)小于主/ 次壺腹腺絲，但由于連續(xù)出現(xiàn)的GPGGx模塊含量高，因此鞭毛狀絲具有最好的彈性(> 200%)[9,25].由于主壺腹腺絲擁有強度和彈性的完美結(jié)合且分泌腺易于分離，長期以來一直為蛛絲蛋白研究及仿生領(lǐng)域的焦點.但是由于主壺腹腺絲蛋白編碼基因長、重復(fù)性高等，阻礙了全長MaSp編碼基因的克隆.由于全長基因序列報道有限，蛛絲蛋白的基因以及蛋白結(jié)構(gòu)的研究尚不明確，也無完整蛛絲蛋白的表達(dá)研究，現(xiàn)階段的表達(dá)和仿生均是嘗試對蛛絲蛋白模塊串聯(lián)體的表達(dá)，獲取的擬蛛絲纖維性能遠(yuǎn)不及天然蛛絲.為明確蛛絲基因和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)模式，并為表達(dá)仿生研究提供更多的基因資源，本文以實驗室前期構(gòu)建的A.ventrisosus基因組文庫為基礎(chǔ)[15,26]，結(jié)合3D/PCR方法篩選MaSp1編碼基因，并對通過shotgun測序獲取的部分序列進行分析.

AvMaSp1RC Rep主要由典型的蛛絲蛋白模塊GlyGlyx和poly-Ala組成，由于AvMaSp1RC Rep缺少MaSp2的特征序列GlyProGlyxx，將其劃分為MaSp1家族.AvMaSp1RC Rep與L.hesperusMaSp1Rep較為相似，poly-Ala較長，由6～9個丙氨酸構(gòu)成.Ala和Gly是組成AvMaSp1RC Rep的主要氨基酸，占78%左右(圖3)，而在L.hesperusMaSp1和A.ventricosusMiSp重復(fù)區(qū)中，這兩種氨基酸也分別約占68%[11-12].由于蛛絲蛋白的重復(fù)區(qū)占整個蛋白的95%以上，因此Gly和Ala是構(gòu)成蛛絲蛋白的主要氨基酸.編碼Gly和Ala的密碼子前兩位主要為G或者C，為了減少GC的使用率，防止mRNA形成特殊的二級結(jié)構(gòu)，與L.hesperusMaSp1和A.ventricosusMiSp相似，Gly和Ala密碼子的第三位堿基主要為A或者T，減少了G和C的使用率(圖4)[11-12].但在關(guān)于悅目金蛛管狀腺絲蛋白基因報道中，含量較高的Ser和Gly并未出現(xiàn)明顯的密碼子偏愛性，說明不同種蜘蛛的不同種蛛絲蛋白在密碼子的使用上存在差異[27].

蛛絲蛋白由NT、CT和重復(fù)區(qū)組成，絲性能主要由重復(fù)區(qū)氨基酸決定，非重復(fù)末端NT和CT則主要參與絲素蛋白纖維化的調(diào)節(jié)及成絲過程，保守性高[20,28].通過對AvMaSp1RC CT與部分已知蛛絲蛋白CT的比對分析，發(fā)現(xiàn)Arg，Asp，Glu以及Lys在參與比對的蛛絲蛋白CT中高度保守，保守的Arg，Asp以及Glu可參與鹽鍵的形成，通過感應(yīng)pH值的變化控制CT蛋白的穩(wěn)定性[19,29].研究發(fā)現(xiàn)QALL模塊在MiSp和MaSp CT中高度保守，該區(qū)域疏水性高，位于α-helix 4中，推測這種疏水作用與CT的二聚化有關(guān).另外，MaSp中還擁有保守的Cys，研究表明Cys可以形成鏈間二硫鍵，促進穩(wěn)定CT二聚體的形成[19].MiSp CT主要通過輸水作用和離子鍵形成二聚體，而MaSp CT通過二硫鍵、疏水作用以及離子鍵形成更加穩(wěn)定的二聚體，可能與主壺腹腺絲的高強度相關(guān).研究表明，MiSp的CT模塊可溶性較MaSp CT好，可在常溫下保存和操作，MaSp CT則容易發(fā)生聚集現(xiàn)象，此現(xiàn)象的具體機制尚不明確[29].AraneusdiadematusMaSp 和NephilaantipodianaMiSp CT主要由5個α-helix組成[19,29]，因此，利用PSIPRED對AvMaSp1RC CT進行了二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，AvMaSp1RC CT與上述的CT末端二級結(jié)構(gòu)相似，二級結(jié)構(gòu)主要也為5個α-helix.

系統(tǒng)進化樹表明，AvMaSp1RC與A.trifasciataMaSp2和A.bruennichiMaSp1位于同一節(jié)點之內(nèi)，為MaSp蛋白家族新成員.本文研究為蛛絲蛋白編碼基因的結(jié)構(gòu)模式以及蛛絲蛋白二聚化研究提供基礎(chǔ)，為仿生學(xué)的研究提供了更多的基因資源;同時，也為本課題組目前正在開展的利用Intein(蛋白質(zhì)內(nèi)含子)剪接合成長片段蛛絲蛋白以及后續(xù)的人工紡絲提供了資源，為蜘蛛絲的深入研究和開發(fā)打下了良好基礎(chǔ)，期望利用此基因序列表達(dá)出性能更為優(yōu)良的蛛絲蛋白，并進行細(xì)胞培養(yǎng)等方面的實驗，進而應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、軍事等多領(lǐng)域的研究.

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Screen and Sequence Analysis of Major Ampullate Spidroin Gene-1fromAraneusVentricosus

ZHANGXue,CHENGe-fei,MENGQing

(Institute of Biological Science and Biotechnology,Donghua University,Shanghai 201620,China)

To research the spider silk protein coding gene architecture，protein modules and supply different kinds of gene resources for bio-mimicing spider silk,major ampullate spidroin gene-1(MaSp 1)gene is screened from anAraneusventricosus(A.ventricosus)Fosmid gene library by 3D/PCR (three-dimensional polymerase chain reaction)technology and partial MaSp1sequence is analyzed.By screening the Fosmid gene library,a positive clone containing the MaSp1gene is obtained,termed Av11-19-5,which is now being sequenced,and partial MaSp1coding gene,MaSp1RC,has already been found out.MaSp1RC is 786 bp in size and encodes 262 amino acids which can be divided into non-repetitive C terminal domain(CT) and repetitive domain(Rep).The Rep is mainly composed of poly-Ala,Glyxand GlyGlyxmodules,in which Ala and Gly content is about 78%.In CT domain,amino acids involved in forming salt bridge and hydrophobic domain in elix 4are highly conserved.The study result supplies a new biomimetic gene resource,and gives a basis for working with spider silk protein coding gene architecture and dimerization.

Araneusventricosus; major ampullate spidroin; 3D/PCR technology; sequence analysis

1671-0444(2015)01-0053-07

2013-11-04

國家“八六三”高技術(shù)研究發(fā)展計劃資助項目(2006AA03Z451)；國家自然科學(xué)基金資助項目(31070698)；上海市基礎(chǔ)研究重點資助項目(10JCl400300)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金資助項目(20120075110007)

張 雪(1988—)，女，上海人，碩士研究生，研究方向為蛛絲蛋白基因的篩選及分析．E-mail：zhangjessi@126.com

孟 清(聯(lián)系人)，男，教授，E-mail：mengqing@dhu.edu.cn

Q 78

A