張成才，宋艷艷，周夢嬌，崔志倩，張西臣，邢沈陽

(1. 吉林大學動物科學學院動物科學系，吉林 長春 130062；2. 吉林大學第二醫(yī)院腎病內科，吉林 長春 130041；3. 吉林大學動物醫(yī)學學院預防獸醫(yī)學系，吉林 長春 130062)

RNA干擾YWHAZ基因對結腸癌HCT-8細胞增殖的影響

張成才1，宋艷艷2，周夢嬌1，崔志倩1，張西臣3，邢沈陽1

(1. 吉林大學動物科學學院動物科學系，吉林 長春 130062；2. 吉林大學第二醫(yī)院腎病內科，吉林 長春 130041；3. 吉林大學動物醫(yī)學學院預防獸醫(yī)學系，吉林 長春 130062)

目的：探討中RNA干擾YWHAZ基因對結腸癌HCT-8細胞增殖的影響，闡明其作用機制。方法：構建靶向基因YWHAZ的siRNA載體重組質粒pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612和pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505作為RNA干擾質粒組，同時設立陰性對照質粒組(pGPU6/GFP/Neo-shNC質粒)；采用熒光定量PCR檢測YWHAZ mRNA的表達水平和表達抑制率；采用MTT法檢測HCT-8細胞的增殖率。結果：倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞轉染率為60%。熒光定量PCR檢測，RNA干擾組YWHAZ mRNA表達水平低于陰性對照組(P<0.01)，平均抑制率為52.86%。MTT檢測，與陰性對照組比較，RNA干擾質粒組細胞增殖率明顯降低(P<0.01)，平均細胞增殖率為68.75%。結論：干擾YWHAZ可抑制該基因的轉錄，并抑制HCT-8細胞的增殖。

YWHAZ基因；結腸腫瘤；HCT-8細胞；RNA干擾

在常見的惡性腫瘤中，結腸癌的發(fā)病率呈逐年增加趨勢，尋找特異的診斷及治療靶點十分重要。YWHAZ屬于14-3-3基因家族，其家族成員有7種亞型β、γ、ζ、η、ε、σ和τ，是一個在真核生物中廣泛表達的酸性蛋白家族，其中14-3-3ζ的編碼基因為YWHAZ。研究[1-8]表明：YWHAZ在腫瘤遷移、抑制細胞凋亡和調控信號傳導等方面發(fā)揮重要作用，其在胃癌、肺癌及肝癌等多種惡性腫瘤組織中均表達異常。YWHAZ與腫瘤的發(fā)生有密切的關聯(lián)，其過表達可引起抑癌基因p53表達水平下降導致腫瘤發(fā)生[9-10]，但YWHAZ對結腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響尚不明確。本實驗通過干擾結腸癌細胞系中YWHAZ mRNA的表達，觀察結腸癌細胞的增殖情況，采用RNAi技術了解YWHAZ對結腸癌的影響，以期為結腸癌的有效治療提供一個新的基因靶點。

1　材料與方法

1.1細胞、質粒和主要試劑結腸癌HCT-8細胞由本實驗室保存；干擾YWHAZ質粒由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成；細胞總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自上海TOYOBO生物科技有限公司，FuGENE HD轉染試劑購自美國Promega公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自上海浩然生物技術有限公司，SYBR Green熒光定量染料購自大連Takara寶生物工程有限公司。

1.2干擾質粒的構建和實驗分組由上海吉瑪制藥技術有限公司根據NM003406基因序列設計合成干擾質粒。實驗分為RNA干擾質粒組(干擾質粒分別為pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505)和陰性質粒對照組(pGPU6/GFP/Neo-shNC)。

1.3結腸癌HCT-8細胞的瞬時轉染待轉細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數生長期，待細胞融合度達60%～70%時棄去上清，加入室溫孵育15 min后的干擾質粒與FuGENE HD轉染試劑的混合液(轉染試劑∶質粒=5 μL∶2 μg)及不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h。倒掉含轉染試劑的培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h。在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，統(tǒng)計發(fā)光細胞數量，計算轉染效率，轉染效率=發(fā)光細胞數/細胞總數×100%。

1.4細胞總RNA的提取及反轉錄cDNA利用Trizol法提取各組細胞總RNA，測定RNA濃度，并調整一致。TOYOBO反轉錄體系：Total RNA 7.0 μL、RT-primer 0.5 μL、RT Enzyme Mix 0.5 μL、5×RT Buffer 2.0 μL，反轉錄為cDNA，-80℃保存?zhèn)溆?，在進行PCR反應之前以1∶10稀釋。

1.5熒光定量PCR法檢測YWHAZ基因mRNA的表達水平和表達抑制率根據YWHAZ序列設計引物，上游引物：5′-ATTGAGACGGAGCTAAGAGATATCT-3′;下游引物：5′-CTCAGCCAAGTAACGGTAGTAATCT-3′;設置內參為β-actin，內參上游引物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′；下游引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。熒光定量PCR反應20.0 μL體系：cDNA 2.0 μL、PCR-Master Mix 10.0 μL、PCR-F-Primer 0.5 μL、PCR-R-Primer 0.5 μL、RNase free H2O 7.0 μL，每份樣本重復3次。反應條件：95℃預變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。產物4℃保存?zhèn)溆?。通過Ct值計算機自動生成原始定量結果，按照相對定量的方法，利用YWHAZ基因與內參β-actin的定量結果計算2-ΔΔCt值，YWHAZ mRNA表達抑制率=(1-YWHAZ基因相對表達水平)×100%。

1.6MTT法檢測HCT-8細胞增殖率將含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞吹打為單細胞懸液，接種到96孔板內(每孔200 μL，約含5×103個細胞)，每組6個重復，37℃、5%CO2培養(yǎng)12～24 h，每孔加入20 μL MTT溶液，4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，放入搖床振蕩10 min，使結晶物充分溶解。利用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值。以時間、A490值分別為橫、縱坐標繪制生長曲線。細胞增殖率=實驗組平均A值/對照組平均A值×100%。

2　結　果

2.1RNA提取收集轉染后RNA干擾質粒組及陰性質粒對照組細胞，利用Trizol法提取細胞總RNA，經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測可知，RNA提取效果較好，5s、18s和28s條帶清晰。見圖1。

Lanes 1-4:RNA interference plasmid group; Lane 5:Negative control plasmid group.

圖1各組YWHAZ RNA表達電泳圖

Fig.1Electrophoregram of expressions of YWHAZ RNA in various groups

2.2重組質粒瞬時轉染細胞的轉染效率利用倒置熒光顯微鏡觀察轉染后的細胞，可觀察到綠色熒光(圖2，見插頁五)，表明重組的質粒成功轉入HCT-8細胞中，通過細胞計數，計算轉染效率為60%。

2.3各組YWHAZ mRNA表達水平和表達抑制率RNA干擾質粒組YWHAZ mRNA表達水平分別為0.40±0.01、0.42±0.03、0.56±0.02和0.40±0.04，均低于陰性質粒對照組(1.05±0.05)(P<0.01)；RNA干擾質粒組YWHAZ mRNA表達抑制率分別為57.14%、55.23%、41.90%和57.14%，平均抑制率為52.86%。

2.4各組HCT-8細胞增殖率以各組HCT-8細胞A490值的平均值作為縱坐標，以時間作為橫坐標繪制生長曲線(圖3)。RNA干擾質粒組HCT-8細胞7 d后A值分別為1.62±0.14、1.49±0.11、1.49±0.15和1.55±0.14，均低于陰性質粒對照組(2.23±0.12)(P<0.01)；RNA干擾質粒組HCT-8細胞增殖率分別為72.65%、66.82%、66.82%和69.51%，平均增殖率為68.75%。

圖3　各組HCT-8細胞生長曲線

Fig.3Proliferation curves of HCT-8 cells in various groups

3　討　論

14-3-3蛋白家族在腫瘤的形成和發(fā)展過程中扮演著重要的角色，研究[11]表明：其可以調節(jié)蛋白之間的相互作用并作為信號分子參與到腫瘤生長過程中。在其家族基因中，14-3-3σ已被證實為抑癌基因[12]，14-3-3β與14-3-3γ也被證明有促進腫瘤形成的作用[13]。作為一個潛在的原癌基因[14]，YWHAZ基因對腫瘤的影響及作用機制正逐步成為一個新的研究方向。Bajpai等[15]在對食管鱗狀上皮癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的研究中發(fā)現：14-3-3ζ在ESCC組織中呈高表達。TsuKamoto等[16]對轉染miRNA-375的胃癌細胞中14-3-3ζ mRNA和蛋白表達的研究表明：14-3-3ζ有促進腫瘤細胞生長的作用。Maxwell等[17]在CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和強的松)化療方案耐藥細胞系的研究結論也與這一觀點一致。這些研究結果均表明YWHAZ與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關聯(lián)。

YWHAZ基因在結腸癌的相關研究中報道較少，本實驗利用RNAi技術特異性識別并降解具有同源序列mRNA的能力，觀察干擾YWHAZ基因后，其在結腸癌HCT-8細胞中轉錄水平及細胞增殖水平的差異。本研究結果顯示：在HCT-8細胞中，YWHAZ mRNA的表達水平明顯下降，細胞增殖率顯著降低，說明YWHAZ基因與結腸癌的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。研究[18-19]顯示：在肺癌細胞系中下調YWHAZ的表達水平時，細胞中Bad、Bim/Mcl和Bax等促凋亡因子表達水平升高，肺癌細胞凋亡率升高。Matta等[20-22]發(fā)現：14-3-3ζ蛋白通過與NF-κB、β-連環(huán)蛋白和Bcl-2結合參與到細胞信號轉導通路來提高口腔鱗狀癌細胞的增殖。本研究結果顯示：結腸癌細胞增殖率降低，可能為干擾YWHAZ mRNA的表達使相應的14-3-3ζ表達水平下降，導致細胞中促凋亡因子表達水平升高所致，也可能是14-3-3ζ表達水平降低造成和細胞信號轉導通路中斷所致。有關YWHAZ基因在結腸癌中的作用機制有待進一步研究。

綜上所述，本實驗通過RNAi技術成功干擾HCT-8細胞中YWHAZ mRNA的表達水平，使得細胞增殖率顯著降低，初步了解了YWHAZ基因對結腸癌細胞的影響。結合本實驗及其他學者的研究推測：YWHAZ基因有可能作為一個新的診斷和治療結腸癌的靶點。

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Effect of RNA interference of YWHAZ gene on proliferation of colon cancer HCT-8 cells

ZHANG Chengcai1，SONG Yanyan2，ZHOU Mengjiao1，CUI Zhiqian1，ZHANG Xichen3，XING Shenyang1

(1. Department of Animal Science,School of Animal Science,Jilin University,Changchun 130062, China;2. Department of Nephrology,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China; 3. Department of Preventive Veterinary Medicine,School of Veterinary Medicine, Jilin University,Changchun 130062,China)

ObjectiveTo investigate the effect of RNA interference of YWHAZ gene on the cell proliferation of colon cancer HCT-8 cells,and to elucidate the mechanism.Results Four siRNA plasmids targeting human YWHAZ gene,including pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792,pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733,pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612,and pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505, were constructed and regarded as RNA interference plasmid groups. pGPU6/GFP/Neo-shNC plasmid was regarded as negative control plasmid group. RT-PCR was used to detect the expression of YWHAZ mRNA and the inhibitory rates of HCT-8 cells; the proliferation rate of HCT-8 cells was detected by MTT method. ResultsThe transfection rate of cells was 60% under inverted fluorescence microscope;the RT-PCR results showed that the levels of YWHAZ mRNA in RNA interference plasmid groups were lower than those in negative control plasmid group(P<0.01),and the average inhibitory rate was 52.86%. The MTT results showed that compared with negative control plasmid group,the proliferation rates of HCT-8 cells in RNA interference plasmid groups were decreased (P<0.01),and the average proliferation rate was 68.75%. ConclusionInterference of YWHAZ gene might inhibit the transcription of the gene,and further inhibit the proliferation of HCT-8 cells.

YWHAZ gene;colon neoplasms;HCT-8 cells;RNA interference

1671-587Ⅹ(2015)02-0307-04

10.13481/j.1671-587x.20150220

2014-11-06

吉林省科技廳科技發(fā)展計劃項目資助課題(2003055025，20106044)；吉林省自然科學基金資助課題(20101585)

張成才(1989-)，男，山東省濰坊市人，在讀動物科學碩士，主要從事腫瘤遺傳學方面的研究。

邢沈陽，教授，碩士研究生導師(Tel:0431-87835138,E-mail:xingsy6177@163.com)

R735.3

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