洪康康， 邵鄰相

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

小分子團(tuán)水在雞血紅細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)速率*1

洪康康， 邵鄰相

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

研究了小分子團(tuán)水在雞血紅細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)速率．采用低滲水樣處理雞血紅細(xì)胞懸液、倒置顯微鏡觀察細(xì)胞吸脹過程并拍照記錄，統(tǒng)計(jì)了顯微拍攝照片中的細(xì)胞脹破率，比較了各水樣在雞血紅細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)速率．結(jié)果表明，在低滲條件下，小分子團(tuán)水在雞血紅細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)速率小于普通水．雞血紅細(xì)胞懸液和碳酸氫鈉水溶液混合后觀察細(xì)胞脹破率，發(fā)現(xiàn)隨著pH值增大，水分子在雞血紅細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)速率變慢.小分子團(tuán)水低滲處理效果與碳酸氫鈉水溶液(較高pH值)低滲處理效果類似．在低滲條件下小分子團(tuán)水在雞血紅細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)速率比普通水更慢，可能與小分子團(tuán)水的高pH值相關(guān)．

小分子團(tuán)水；脹破率；pH；轉(zhuǎn)運(yùn)速率；雞血紅細(xì)胞

水是細(xì)胞最重要的組成部分．普通水由10個(gè)以上水分子組成一個(gè)水分子團(tuán)簇，叫大分子團(tuán)水.小分子團(tuán)水由5～6個(gè)水分子締結(jié)而成．小分子團(tuán)水的開發(fā)利用具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，水分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)已逐漸成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1-4]．用17O核磁共振譜線寬技術(shù)發(fā)現(xiàn)小分子團(tuán)水的團(tuán)簇比普通水更小[5]，拉曼誘導(dǎo)克爾效應(yīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小分子團(tuán)水的存在結(jié)構(gòu)不如普通水穩(wěn)定[6]．普通水轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿訄F(tuán)水后,會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的水合特性、氨基酸分子間氫鍵的強(qiáng)弱及溶菌酶的活性產(chǎn)生影響[7-11]，能促進(jìn)人血紅細(xì)胞對(duì)Cu2+的攝入[12]，增強(qiáng)水自身的溶解力、滲透力、代謝力、擴(kuò)散力和乳化力[13-14]．

一些企業(yè)的宣傳資料認(rèn)為，小分子團(tuán)水具有比普通水更快的進(jìn)出細(xì)胞的速率，具有促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝的作用.然而，小分子團(tuán)水的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)對(duì)水分跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率影響的相關(guān)研究文獻(xiàn)甚少，筆者檢索到的文獻(xiàn)僅有1篇：葉紅梅等[15]用駿豐頻譜儀制備的小分子團(tuán)水與普通蒸餾水配制不同濃度的氯化鈉溶液，加入紅細(xì)胞后離心，測上清液的吸光度比較血紅蛋白含量，從而對(duì)小分子團(tuán)水與普通蒸餾水對(duì)紅細(xì)胞的滲透速率進(jìn)行了比較．

小分子團(tuán)水是否能更快地進(jìn)出細(xì)胞、促進(jìn)新陳代謝，存在巨大的爭議．本文采用小分子團(tuán)水低滲處理雞血紅細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞吸脹過程并拍照記錄，統(tǒng)計(jì)了顯微圖片中的細(xì)胞脹破率，從細(xì)胞水平驗(yàn)證了小分子團(tuán)水的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)是否具有促進(jìn)水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率的能力，為小分子團(tuán)水的商業(yè)開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1水樣來源

蒸餾水由SZ-96A型自動(dòng)純水蒸餾器制備；超純水由南京易普易達(dá)純水器制備；娃哈哈純凈水購自杭州娃哈哈集團(tuán)；農(nóng)夫山泉礦泉水購自農(nóng)夫山泉股份有限公司；自來水來自本實(shí)驗(yàn)室.1號(hào)小分子團(tuán)水購自××××生物科技有限公司；2號(hào)小分子團(tuán)水購自×××生物營養(yǎng)科技有限公司．

1.2雞血紅細(xì)胞懸液的制備

杏花雞購自農(nóng)貿(mào)市場．雞翅根部取血[16]，肝素鈉抗凝[17]，鳥類生理鹽水清洗，Sigma離心機(jī)1 000 r/min離心5 min，清洗3遍，制備成400倍的雞血紅細(xì)胞懸液．

1.3水樣理化性質(zhì)的檢測

HANNA 213型離子酸度計(jì)(HI1053純水專用電極)測量水樣的pH；2WAJ型阿貝折射儀測量水樣的折光率；DDS-307型電導(dǎo)率儀測量水樣的電導(dǎo)率；BZY-101表面張力儀測量水樣的表面張力；Ultrospec 4000紫外光譜儀測量水樣在190～300 nm波長的紫外吸收光譜．

1.4雞血紅細(xì)胞脹破率的檢測

在48孔細(xì)胞板上，每孔加入雞血紅細(xì)胞懸液70 μL和水樣130 μL，混勻后立即開啟顯微鏡定時(shí)拍照攝影功能，將48孔細(xì)胞板放置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上，13 min后拍照結(jié)束，統(tǒng)計(jì)顯微拍攝照片中的細(xì)胞脹破率．

1.5水樣和雞血紅細(xì)胞懸液混合液pH的測定

雞血紅細(xì)胞懸液35 mL，處理組水樣65 mL，混勻，測定pH值．

1.6pH對(duì)雞血紅細(xì)胞脹破率的影響

分別配置濃度為0.037，0.074，0.111，0.148，0.185，0.222，0.259，0.296，0.333和0.370 mol/L碳酸氫鈉溶液，與紅細(xì)胞懸液按體積比為65∶35混合后，測量混合液的pH值．

另取上述不同濃度的碳酸氫鈉溶液，與紅細(xì)胞懸液作用后測定細(xì)胞脹破率．

1.7數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.17種水樣的理化性質(zhì)

如表1和圖1所示：電導(dǎo)率高低和水樣本身的離子濃度呈正相關(guān)，1號(hào)小分子團(tuán)水和2號(hào)小分子團(tuán)水的電導(dǎo)率差異顯著；折光率高低和水樣的密度相關(guān)，7種水樣的折光率相同；表面張力是液體表面由于分子引力不均衡而產(chǎn)生的沿表面作用于任一界線上的張力，小分子團(tuán)水與普通水在液體表面張力上無明顯差異；紫外吸收值與水樣中所含雜質(zhì)相關(guān)，小分子團(tuán)水含有雜質(zhì)的量比農(nóng)夫山泉礦泉水少，比蒸餾水多；小分子團(tuán)水與普通水在理化性質(zhì)上相比，最顯著的差異是小分子團(tuán)水具有較高的pH值．

表1 7種水樣的pH、電導(dǎo)率、折光率和表面張力

注：與對(duì)照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01．

圖1 7種水樣190～300 nm紫外光吸收光譜

2.2不同水樣對(duì)雞血紅細(xì)胞脹破率的影響

由表2可見，7種水樣按細(xì)胞脹破率由大到小排序，依次是：超純水、娃哈哈純凈水、蒸餾水、自來水、農(nóng)夫山泉礦泉水、2號(hào)小分子團(tuán)水和1號(hào)小分子團(tuán)水．1號(hào)小分子團(tuán)水和2號(hào)小分子團(tuán)水的脹破率無明顯的差異(卡方值P<0.05)．

表2 7種水樣處理13 min后雞血紅細(xì)胞的脹破率

由圖2可見：正常雞血紅細(xì)胞在形態(tài)上呈尖梭狀；蒸餾水(pH 6.54)、超純水(pH 6.50)和娃哈哈純凈水(pH 6.58)的雞血紅細(xì)胞脹破的細(xì)胞內(nèi)容物大量外泄，僅留下血影，而未脹破的細(xì)胞在形態(tài)上呈圓球狀;農(nóng)夫山泉礦泉水(pH 7.11)的未脹破雞血紅細(xì)胞一部分呈圓球狀，一部分呈圓梭狀;1號(hào)小分子團(tuán)水(pH 7.49)的未脹破雞血紅細(xì)胞大部分呈圓梭狀，小部分呈尖梭狀;2號(hào)小分子團(tuán)水(pH 8.53)的未脹破雞血紅細(xì)胞大部分呈尖梭狀．雞血紅細(xì)胞在脹破率和形態(tài)上的變化可能與水樣的pH相關(guān)．

圖2 7種水樣低滲處理13 min對(duì)雞血紅細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3pH對(duì)雞血紅細(xì)胞脹破率的影響

小分子團(tuán)水在雞血紅細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)比普通水更慢，是否與pH相關(guān)？筆者設(shè)計(jì)了pH對(duì)水分子在雞血紅細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)速率影響的實(shí)驗(yàn)．由表3、表4和圖3可見，隨著pH值升高，雞血紅細(xì)胞的脹破率先顯著下降、再保持穩(wěn)定，且穩(wěn)定后的脹破率和小分子團(tuán)水處理組的脹破率十分接近(約9.5%)，說明小分子團(tuán)水和較高pH值的碳酸氫鈉水溶液在雞血紅細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)速率相似．對(duì)小分子團(tuán)水和近似pH的水溶液關(guān)于細(xì)胞脹破率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果如表5所示：1號(hào)小分子團(tuán)水的pH值介于7.39和7.48之間，1號(hào)小分子團(tuán)水與pH 7.39混合液、pH 7.48混合液在細(xì)胞脹破效果上無顯著差異(卡方值P<0.05)；2號(hào)小分子團(tuán)水的pH值介于7.75和7.83之間，2號(hào)小分子團(tuán)水和pH 7.75混合液、pH 7.83混合液在細(xì)胞脹破效果上無顯著差異(卡方值P<0.05)．由圖4可見：隨著水樣pH值的升高，尖梭形細(xì)胞的比例逐漸提高，圓梭形細(xì)胞的比例逐漸減少；當(dāng)水樣的pH值達(dá)到7.90及以上時(shí)，雞血紅細(xì)胞低滲處理13 min后的形態(tài)與正常狀態(tài)下的雞血紅細(xì)胞形態(tài)相似．

表3 添加雞血紅細(xì)胞懸液前后水樣的

表4 pH對(duì)雞血紅細(xì)胞脹破率的影響

圖3 11種不同pH水樣低滲處理13 min對(duì)雞血紅細(xì)胞形態(tài)的影響

表5 小分子團(tuán)水和相似pH水溶液細(xì)胞脹破率的卡方檢驗(yàn)結(jié)果

注：以對(duì)應(yīng)的小分子團(tuán)水為對(duì)照，*表示P<0.05，**表示P<0.01．

本研究表明，小分子團(tuán)水在雞血紅細(xì)胞質(zhì)膜上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率主要受pH影響．Gordon等[18]指出，較高pH能起到抑制水通道蛋白1(AQP1)的作用.小分子團(tuán)水可能通過較高的pH對(duì)雞血紅細(xì)胞的APQ1產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致小分子團(tuán)水比普通水在雞血紅細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)的速率更慢．

圖4 pH對(duì)雞血紅細(xì)胞脹破率的影響

3 結(jié) 論

1)在低滲條件下，小分子團(tuán)水在雞血紅細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)速率小于普通水．2)小分子團(tuán)水的pH值高于普通水．3)隨著pH值升高，水分子在雞血紅細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)速率變慢．4)在低滲條件下小分子團(tuán)水在雞血紅細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)速率比普通水更慢，可能與小分子團(tuán)水的高pH值相關(guān)．

[1]Pradzynski C C，F(xiàn)orck R M，Zeuch T，et al．A fully size-resolved perspective on the crystallization of water clusters[J]．Science，2012，337(6101)：1529-1532．

[2]Miyazaki M，F(xiàn)ujii A，Ebata T，et al．Infrared spectroscopic evidence for protonated water clusters forming nanoscale cages[J]．Science,2004，304(5674)：1134-1137．

[3]Ball P．Water：an enduring mystery[J]．Nature,2008，452(7185)：291-292．

[4]Cobar E A，Hom P R，Bergman R G，et al．Examination of the hydrogen-bonding networks in small water clusters (n=2～5，13，17) using absolutely localized molecular orbital energy decomposition analysis[J]．Physical Chemistry Chemical Physics，2012，14(44)：15328-15339．

[5]李福志，張曉健，呂木堅(jiān)．用17O核磁共振研究液態(tài)水的團(tuán)簇結(jié)構(gòu)[J]．環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(1)：6-9．

[6]Woutersen S，Emmerichs U，Bakker H J．Femtosecond mid-IR pump-probe spectroscopy of liquid water：Evidence for a two-component structure[J]．Science，1997，278(5338)：658-660．

[7]和勁松，楊宏偉，蔡然，等．β-乳球蛋白在磁化水中的水合作用：磁化處理對(duì)水分子締合構(gòu)造及蛋白質(zhì)水合特性的影響[J]．物理化學(xué)學(xué)報(bào)，2010，6(2)：304-310．

[8]Na Ping，Chen Baihua，Wang Yunfen，et al．Analysis and simulation of molecular dynamics of lysozyme in water cluster system[J]．Transactions of Tianjin University，2012，18(1)：1-7．

[9]師留印．不同尺度水分子簇生物效應(yīng)的研究[D]．天津:天津大學(xué)化工學(xué)院，2009．

[10]楊海艷．納米水分子簇的特性與生物學(xué)效應(yīng)[D]．天津:天津大學(xué)化工學(xué)院，2010．

[11]王運(yùn)芬．小分子水簇與蛋白質(zhì)相互作用的分子動(dòng)力學(xué)研究[D]．天津:天津大學(xué)化工學(xué)院，2010．

[12]頓珠次仁．磁場和冷凍作用對(duì)水團(tuán)簇特性及Cu(Ⅱ)跨膜行為的影響研究[D]．天津:天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，2010．

[13]張建平，趙林，譚欣．水分子團(tuán)簇結(jié)構(gòu)的改變及其生物效應(yīng)[J]．化學(xué)通報(bào)，2004(4)：278-283．

[14]Wang Jing，Zhao Feng，Chen Baihua，et al．Small water clusters stimulate microcystin biosynthesis in cyanobacterial microcystis aeruginosa[J]．Journal of Applied Phycology，2012，25(1)：329-336．

[15]葉紅梅，劉瑞英，皮江，等．小分子團(tuán)水與普通蒸餾水的紅細(xì)胞滲透速率比較[J]．科技創(chuàng)新導(dǎo)報(bào)，2011(9)：6-7．

[16]趙巧輝，劉孟洲．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采血方法[J]．上海畜牧獸醫(yī)通訊，2006(4)：51-53．

[17]高海濤，邵鄰相．魔芋膠對(duì)高脂小鼠血脂和抗氧化能力的影響[J]．浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，36(2)：205-208．

[18]Cooper G J,Zhou Yuehan,Bouyer P，et al．Transport of volatile solutes through AQP1[J]．The Journal of Physiology，2002，542(1)：17-29．

(責(zé)任編輯 薛 榮)

Smallmoleculesofwater′stransmembranetransportspeedwithinchickenerythrocytemembrane

HONG Kangkang, SHAO Linxiang

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China)

It was studied the transmembrane transport speed of small water molecules within chicken erythrocyte membrane. Several kinds of hypotonic water were used in the experiment with chicken erythrocytes, inverted microscope was used to observating and recording. The results showed that small molecules of waters′ transmembrane transport speed were lower than that of ordinary water′s. When different concentrations of sodium bicarbonate solution acted on chicken erythrocytes, it was found that the higher of the pH, the higher of the cell burst rate. When the pH of sodium bicarbonate solution was high, the effect on cells burst rate of sodium bicarbonate solution was more similar to small molecules of water′s. The transmembrane transport speed of small molecules of water was lower than ordinary water′s, because the value of small molecules of water′s pH was high.

small molecules of water; cell burst rate; pH; transport rate; chicken erythrocyte membrane

10.16218/j.issn.1001-5051.2015.02.015

2014-12-15

洪康康(1990-)，男，浙江金華人，碩士研究生．研究方向：細(xì)胞生物學(xué)．

邵鄰相．E-mail： shaolinxiang@zjnu.cn

Q331

A

1001-5051(2015)02-0206-06