超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法直接測(cè)定嬰幼兒乳粉中?；撬?/h1>
2015-08-15 10:59:58陳曉峰解迎雙
食品科學(xué) 2015年24期
陳曉峰，周 圍*，解迎雙
（1.西北師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730010）
超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法直接測(cè)定嬰幼兒乳粉中牛磺酸
陳曉峰1，周 圍2，*，解迎雙2
（1.西北師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州730010）
采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，以嬰幼兒乳粉中的牛磺酸為研究對(duì)象，從樣品處理方法，基質(zhì)效應(yīng)以及影響電噴霧離子源的電離因素3 個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，建立了一個(gè)樣品處理簡(jiǎn)單、快捷，基質(zhì)效應(yīng)低，靈敏度高的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，方法的回收率在72%～97%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.16%～3.33%。該方法的儀器檢出限為50 μg/L，方法檢出限為1 mg/L，應(yīng)用外標(biāo)法定量，能夠達(dá)到歐盟及我國(guó)嬰幼兒乳粉中?；撬岬臋z測(cè)要求。整個(gè)分析過(guò)程在8 min內(nèi)完成，適合于大批量檢測(cè)嬰幼兒乳粉中?；撬岬臏y(cè)定。
超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；基質(zhì)效應(yīng)；嬰幼兒乳粉；?；撬?/p>
牛磺酸又稱α-氨基乙磺酸，最早由牛黃中分離出來(lái)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是一種含硫的非蛋白氨基酸，適量的?；撬岽龠M(jìn)機(jī)體的激素分泌，增強(qiáng)和改善機(jī)體的各種功能，牛磺酸是調(diào)節(jié)機(jī)體正?；顒?dòng)的活性物質(zhì)，而缺乏?；撬釙?huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生［1-3］。近年來(lái)，?；撬岜惶砑釉趮胗變喝榉壑?，以期達(dá)到補(bǔ)充機(jī)體氨基酸的作用。我國(guó)在GB 10765—2010《嬰兒配方食品》中明確規(guī)定?；撬岬南蘖孔罡咧挡坏贸^(guò)0.130 mg/g［4-7］，歐洲共同體委員會(huì)則建議嬰幼兒乳粉中?；撬岬暮坎坏贸^(guò)12 mg/100 kcal（約400 mg/100 g）［8］。因此測(cè)定乳粉中?；撬岬暮烤哂兄匾饬x。
目前，國(guó)內(nèi)外測(cè)定嬰幼兒乳粉中?；撬岬姆椒ㄖ饕械味ǚǎ?-10］、比色法［11］、薄層掃描法［12-13］、高效液相色譜法［14-17］和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［18-19］等。其中滴定法、比色法和薄層掃描法容易受氨基酸的干擾，誤差相對(duì)較大；高效液相色譜法不能直接對(duì)?；撬徇M(jìn)行測(cè)定，需要利用柱前或柱后衍生進(jìn)行檢測(cè)，操作較為繁瑣，重復(fù)性差［20］。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)乳粉中的?；撬嶂苯舆M(jìn)行檢測(cè)，具有高選擇性、樣品處理簡(jiǎn)單快速、高靈敏度、抗干擾性強(qiáng)和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到滿意效果。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
亞鐵氰
化鉀、硫酸鋅、乙酸鋅（均為分析純）天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純）德國(guó)Merck公司；乙酸胺（色譜純）天津市登峰化學(xué)試劑廠；?；撬針?biāo)準(zhǔn)品農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。
1.2儀器與設(shè)備
TE124S分析天平（感量：±0.1 mg）德國(guó)Sartorius公司；BL310百分之一天平（感量：±0.01 g）北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；MS3 Digital渦旋儀德國(guó)Ikams公司；3K30離心機(jī)美國(guó)Sigma公司；SK8200H超聲清洗儀上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；ZWF334振蕩儀上海智城分析儀器制造有限公司；移液槍德國(guó)Eppendorf公司；1290-6460超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源）美國(guó)Agilent公司。
1.3方法
1.3.1液相色譜條件
ACQUITY BEHTMHILIC色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A：50 mmol/L乙酸銨溶液，B：乙腈；進(jìn)樣量0.5 μL；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min梯度洗脫，見(jiàn)表1。
表1 液相色譜梯度洗脫程序表Table 1 LC gradient elution program
1.3.2質(zhì)譜條件
電噴霧離子源離，離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓3 500 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流量7 L/min；霧化氣壓力45 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流量11 L/min；電離方式：電噴霧離子源，負(fù)離子模式；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）。牛磺酸質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)設(shè)定見(jiàn)表2。
表2?；撬豳|(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)設(shè)定表
TTaabbllee 22 MMaassss ssppeeccttrraall ppaarraammeetteerrss ffoorr ttaauurriinnee ddeetteeccttiioonn
參數(shù) 定性離子（m/z）定量離子對(duì)（m/z）駐留時(shí)間/s錐孔電壓/V碰撞池電壓/V?；撬帷 ?24.0 79.9 200 120 10 107 10
1.3.3樣品處理
稱取2.00 g（±0.05 g）乳粉樣品于50 mL離心管中，加入35 mL純凈水，渦旋5 min；用移液槍準(zhǔn)確加入2.50 mL 1.199 mol/L乙酸鋅和2.50 mL 0.25 mol/L硫酸亞鐵氰化鉀溶液后定容至50 mL，渦旋5 min；于4 ℃，13 000 r/min離心5 min；取上清液1.0 mL過(guò)0.22 μm膜于進(jìn)樣瓶中，備超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。
2 結(jié)果與分析
2.1樣品處理結(jié)果
圖 1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)（10 mg/L）譜圖（A）、乳粉樣品譜圖（BB）Fig.1 Mass spectra of taurine standard （10 mg/L） （A） and milk powder sample （B）
乳粉樣品中含有大量的蛋白質(zhì)，給?；撬岬臋z測(cè)帶來(lái)了困難，所以在分析時(shí)首先要除去樣品中的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有的除去蛋白質(zhì)的方法主要有固相萃取法［21-22］和蛋白沉淀法［23-24］。固相萃取法原理是當(dāng)樣液經(jīng)過(guò)固相色譜柱時(shí)，?；撬釋?huì)被固相萃取柱中的固定相保留，而蛋白質(zhì)則隨樣液流出，以達(dá)到分離的目的。該方法具有樣品凈化效率高的優(yōu)點(diǎn)，但固相萃取柱成本較高，凈化步驟較為繁瑣。蛋白沉淀法則是通過(guò)向提取液中加入沉淀劑使蛋白沉淀來(lái)達(dá)到凈化目的，該方法操作簡(jiǎn)便、快捷，因此本實(shí)驗(yàn)使用蛋白沉淀法進(jìn)行樣品處理。
本實(shí)驗(yàn)分別選用了乙腈、硫酸鋅、硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅的混合溶液做為沉淀劑來(lái)去除樣品中的蛋白質(zhì)。采用乙腈作為蛋白沉淀劑，由于?；撬岵蝗苡谝译?，因此部分?；撬釙?huì)隨蛋白一同沉淀，回收率較低，不能滿足檢測(cè)要求；采用硫酸鋅去除蛋白效果較好，經(jīng)硫酸鋅去除蛋白后樣液澄清，且硫酸鋅溶液對(duì)牛磺酸的提取效率較高，但使用該方法對(duì)于含糖量較高的乳粉進(jìn)行處理時(shí)，回收率較低，只有60%左右，因此乙酸鋅作為沉淀劑不適用于含糖乳粉中?；撬岬臋z測(cè)；而采用硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅的混合液作為一種蛋白沉淀劑，利用乙酸鋅與亞鐵氰化鉀發(fā)生反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅沉淀來(lái)挾走或吸附干擾物質(zhì)，可用于乳粉樣品的蛋白沉淀以及可溶性糖類的凈化，因此本實(shí)驗(yàn)選擇硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑達(dá)到了滿意的樣品處理效果。如圖1所示。
2.2質(zhì)譜分析中對(duì)樣品的基質(zhì)效應(yīng)的去除
基質(zhì)效應(yīng)主要表現(xiàn)為使用同一條件進(jìn)行分析時(shí)，相同質(zhì)量濃度的目標(biāo)物質(zhì)在純?nèi)軇┲泻突|(zhì)中的影響存在較大的差異。如圖2所示，將500 μg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一條件下，經(jīng)C18柱分析后，溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰形呈高斯分布，響應(yīng)較高，而基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰形很差，不能達(dá)到檢測(cè)要求。主要是因?yàn)榻?jīng)1.3.3節(jié)方法處理后的樣品中含有大量的脂肪類物質(zhì)并未去除，經(jīng)C18色譜柱進(jìn)行分析時(shí)，?；撬岜Ａ糨^弱，與樣液中的脂肪類物質(zhì)同時(shí)被洗脫進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)，降低?；撬岬碾x子化效率，基質(zhì)效應(yīng)比較明顯。
圖2 經(jīng)CC1188色譜柱分析后?；撬峄|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)比譜圖Fig.2 Comparative mass spectra of taurine standard in solvent and matrix after separation on C18column
目前常見(jiàn)的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法一般有加入同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物、優(yōu)化樣品前處理方法、優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件、進(jìn)樣前稀釋、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校準(zhǔn)等。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)優(yōu)化色譜條件（即選擇HILIC色譜柱）來(lái)去除乳粉中脂肪類物質(zhì)對(duì)?；撬岬幕|(zhì)效應(yīng)的影響。HILIC色譜柱采用中性的酰胺鍵合基團(tuán)，利用親水作用色譜原理，對(duì)強(qiáng)極性、水溶性堿性有機(jī)化合物有較好的保留；因此采用HILIC色譜柱對(duì)嬰幼兒乳粉中的?；撬徇M(jìn)行測(cè)定時(shí)，脂肪類物質(zhì)不被HILIC色譜柱所保留率先流出，因此與?；撬嵊休^好的分離，從而有效地去除了基質(zhì)效應(yīng)的影響，能夠達(dá)到乳粉中牛磺酸的檢測(cè)要求，見(jiàn)圖3。
圖 3 經(jīng)HILIC色譜柱分析后?；撬峄|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)譜圖（50000 μgg//LL）Fig.3 Comparative mass spectra of taurine standard in solvent and matrix after separation on HILIC column （500 μgg/L）
2.3質(zhì)譜分析中影響電離因素的優(yōu)化
電噴霧離子源電離技術(shù)的原理是在毛細(xì)管的出口處施加高壓，使從毛細(xì)管流出的液體在高電場(chǎng)中霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑的蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后爆裂為大量的帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，使得被分析的目標(biāo)物以單電荷或多電荷的形式進(jìn)入質(zhì)譜中［25］。
影響電噴霧離子源電離的因素有很多，比如流速、電壓等離子源的設(shè)置，分析物本身的特性，質(zhì)子化物質(zhì)在電噴霧離子源中是低質(zhì)量范圍物質(zhì)干擾的來(lái)源等等。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)霧化器溫度、干燥氣流速以及流動(dòng)相的pH值3 個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)最終確定，最佳的霧化器溫度為300 ℃；最佳的干燥氣流速為7 L/min；流動(dòng)相的緩沖溶液為50 mmol/L乙酸胺。
2.4方法學(xué)考察
2.4.1線性關(guān)系
取?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照逐級(jí)稀釋的原則配制250、200、150、100、50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo)，?；撬豳|(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在50～250 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=661.2x－27 297，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 0。
2.4.2回收率、精密度、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard devition，RSD）、檢出限
為考察樣品前處理對(duì)?；撬崮繕?biāo)物的凈化提取效率，本實(shí)驗(yàn)平行稱取4 個(gè)乳粉樣品各2 g，一個(gè)做空白，另外3 個(gè)添加1 mg/L?；撬崛芤?0、100、200 μL于50 mL的離心管，使用上述方法測(cè)得?；撬岬募訕?biāo)回收率后每一個(gè)點(diǎn)平行做8 次，測(cè)得精密度，見(jiàn)表3。加標(biāo)回收率在72%～97%范圍，RSD在2.16%～3.33%范圍內(nèi)，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度高，精密度高。依據(jù)此方法，該儀器測(cè)定?；撬岬膬x器檢出限為50 μg/L，該方法檢出限為1 mg/L。
表3 回收率及精密度值Taabbllee 33 RReeccoovveerriieess ooff ttaauurriinnee iinn ssppiikkeedd bbllaannkk ssaammppllee%
2.5樣品分析
表 4 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定嬰幼兒乳粉中牛磺酸的結(jié)果Taabbllee 44 TTaauurriinnee ccoonntteenntt ooff iinnffaanntt mmiillkk ppoowwddeerr ddeetteerrmmiinneedd bbyy UPLC-MMSS//MMSSmg/100 g
在市場(chǎng)上隨機(jī)抽取嬰幼兒乳粉8 批，按照實(shí)驗(yàn)所給的條件測(cè)定乳粉中?；撬岬暮?，測(cè)得的結(jié)果以及樣品標(biāo)示?；撬岷咳绫?所示。結(jié)果表明市場(chǎng)售賣的嬰幼兒乳粉中?；撬岬暮颗c樣品標(biāo)示基本一致，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的限量要求。
3 討論與結(jié)論
在Massimo［18］、Mario［19］等對(duì)?；撬岬难芯恐?，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜與超高效薄層色譜質(zhì)譜方法檢測(cè)能量飲料中?；撬岬暮?。Massimo等［18］對(duì)能量飲料中牛磺酸的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便；Mario等［19］采用柱后衍生法檢測(cè)能量飲料中的牛磺酸，此方法操作較復(fù)雜。但能量飲料相對(duì)于嬰幼兒乳粉，沒(méi)有蛋白質(zhì)和脂肪等大分子雜質(zhì)，處理較方便，甚至可以直接測(cè)定；而嬰幼兒乳粉中的蛋白質(zhì)和脂肪影響樣品的處理過(guò)程，需要一個(gè)適合的方法去除這些雜質(zhì)，以免影響樣品的檢出和靈敏度。本實(shí)驗(yàn)在他們研究成果的基礎(chǔ)上，很好地去除了乳粉中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，建立了一套去除基質(zhì)效應(yīng)、優(yōu)化影響電離因素，快速、高效的測(cè)定嬰幼兒乳粉中?；撬岬姆椒?。
本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒乳粉中的牛磺酸，樣品前處理用硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅去除蛋白，并離心過(guò)膜去除雜質(zhì)；方法對(duì)樣品的凈化效果好，操作簡(jiǎn)便，快速。采用HILIC色譜柱進(jìn)行樣品檢測(cè)，可以有效地降低基質(zhì)效應(yīng)，整個(gè)檢測(cè)在8.0 min內(nèi)完成。色譜條件便于掌握，檢出限低；結(jié)果準(zhǔn)確度高，靈敏度高，對(duì)于同時(shí)進(jìn)行大批量樣?jì)胗變喝榉壑信；撬岬臋z測(cè)有重要意義。
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Direct Determination of Taurine in Infant Milk Powder by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
CHEN Xiaofeng1， ZHOU Wei2，*， XIE Yingshuang2
（1. College of Geography and Environmental Science， Northwest Normal University， Lanzhou730070， China；
2. Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Lanzhou730010， China）
Ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was applied for the direct determination of taurine in infant milk powder. The sample pretreatment procedure was optimized， and the matrix effect and the factors influencing electrospray ionization （ESI） were evaluated to establish a simple， rapid， low-matrixeffect and sensitive method for determining taurine. The results showed that the recovery rate of this method was between 72% and 97%， with relative standard deviation ranging from 2.16% to 3.33%. The instrument detection limit was 50 μg/L，and the method detection limit was 1 mg/L. Quantifi cation using an external standard method could meet the requirements of the European Union and China for taurine detection in infant milk powder. The whole analysis can be accomplished in 8 minutes， and is suitable for the determination of taurine in mass detection of infant milk powder.
ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； matrix effects；baby milk powder； taurine
TS252.7
A
1002-6630（2015）24-0280-06
10.7506/spkx1002-6630-201524052
2015-04-01
陳曉峰（1990—），男，碩士研究生，主要從事環(huán)境監(jiān)測(cè)研究。E-mail：ghty0794@foxmail.com
周圍（1953—），男，研究員，博士，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)及食品安全分析研究。E-mail：zhouwei845@163.com
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陳曉峰，周 圍*，解迎雙
（1.西北師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730010）
超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法直接測(cè)定嬰幼兒乳粉中牛磺酸
陳曉峰1，周 圍2，*，解迎雙2
（1.西北師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，甘肅 蘭州730010）
采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，以嬰幼兒乳粉中的牛磺酸為研究對(duì)象，從樣品處理方法，基質(zhì)效應(yīng)以及影響電噴霧離子源的電離因素3 個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，建立了一個(gè)樣品處理簡(jiǎn)單、快捷，基質(zhì)效應(yīng)低，靈敏度高的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，方法的回收率在72%～97%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.16%～3.33%。該方法的儀器檢出限為50 μg/L，方法檢出限為1 mg/L，應(yīng)用外標(biāo)法定量，能夠達(dá)到歐盟及我國(guó)嬰幼兒乳粉中?；撬岬臋z測(cè)要求。整個(gè)分析過(guò)程在8 min內(nèi)完成，適合于大批量檢測(cè)嬰幼兒乳粉中?；撬岬臏y(cè)定。
超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；基質(zhì)效應(yīng)；嬰幼兒乳粉；?；撬?/p>
牛磺酸又稱α-氨基乙磺酸，最早由牛黃中分離出來(lái)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是一種含硫的非蛋白氨基酸，適量的?；撬岽龠M(jìn)機(jī)體的激素分泌，增強(qiáng)和改善機(jī)體的各種功能，牛磺酸是調(diào)節(jié)機(jī)體正?；顒?dòng)的活性物質(zhì)，而缺乏?；撬釙?huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生［1-3］。近年來(lái)，?；撬岜惶砑釉趮胗變喝榉壑?，以期達(dá)到補(bǔ)充機(jī)體氨基酸的作用。我國(guó)在GB 10765—2010《嬰兒配方食品》中明確規(guī)定?；撬岬南蘖孔罡咧挡坏贸^(guò)0.130 mg/g［4-7］，歐洲共同體委員會(huì)則建議嬰幼兒乳粉中?；撬岬暮坎坏贸^(guò)12 mg/100 kcal（約400 mg/100 g）［8］。因此測(cè)定乳粉中?；撬岬暮烤哂兄匾饬x。
目前，國(guó)內(nèi)外測(cè)定嬰幼兒乳粉中?；撬岬姆椒ㄖ饕械味ǚǎ?-10］、比色法［11］、薄層掃描法［12-13］、高效液相色譜法［14-17］和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［18-19］等。其中滴定法、比色法和薄層掃描法容易受氨基酸的干擾，誤差相對(duì)較大；高效液相色譜法不能直接對(duì)?；撬徇M(jìn)行測(cè)定，需要利用柱前或柱后衍生進(jìn)行檢測(cè)，操作較為繁瑣，重復(fù)性差［20］。本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)乳粉中的?；撬嶂苯舆M(jìn)行檢測(cè)，具有高選擇性、樣品處理簡(jiǎn)單快速、高靈敏度、抗干擾性強(qiáng)和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到滿意效果。
1 材料與方法
1.1材料與試劑
亞鐵氰
化鉀、硫酸鋅、乙酸鋅（均為分析純）天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純）德國(guó)Merck公司；乙酸胺（色譜純）天津市登峰化學(xué)試劑廠；?；撬針?biāo)準(zhǔn)品農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。
1.2儀器與設(shè)備
TE124S分析天平（感量：±0.1 mg）德國(guó)Sartorius公司；BL310百分之一天平（感量：±0.01 g）北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；MS3 Digital渦旋儀德國(guó)Ikams公司；3K30離心機(jī)美國(guó)Sigma公司；SK8200H超聲清洗儀上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；ZWF334振蕩儀上海智城分析儀器制造有限公司；移液槍德國(guó)Eppendorf公司；1290-6460超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源）美國(guó)Agilent公司。
1.3方法
1.3.1液相色譜條件
ACQUITY BEHTMHILIC色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A：50 mmol/L乙酸銨溶液，B：乙腈；進(jìn)樣量0.5 μL；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min梯度洗脫，見(jiàn)表1。
表1 液相色譜梯度洗脫程序表Table 1 LC gradient elution program
1.3.2質(zhì)譜條件
電噴霧離子源離，離子源參數(shù)：毛細(xì)管電壓3 500 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流量7 L/min；霧化氣壓力45 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流量11 L/min；電離方式：電噴霧離子源，負(fù)離子模式；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）。牛磺酸質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)設(shè)定見(jiàn)表2。
表2?；撬豳|(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)設(shè)定表
TTaabbllee 22 MMaassss ssppeeccttrraall ppaarraammeetteerrss ffoorr ttaauurriinnee ddeetteeccttiioonn
參數(shù) 定性離子（m/z）定量離子對(duì)（m/z）駐留時(shí)間/s錐孔電壓/V碰撞池電壓/V?；撬帷 ?24.0 79.9 200 120 10 107 10
1.3.3樣品處理
稱取2.00 g（±0.05 g）乳粉樣品于50 mL離心管中，加入35 mL純凈水，渦旋5 min；用移液槍準(zhǔn)確加入2.50 mL 1.199 mol/L乙酸鋅和2.50 mL 0.25 mol/L硫酸亞鐵氰化鉀溶液后定容至50 mL，渦旋5 min；于4 ℃，13 000 r/min離心5 min；取上清液1.0 mL過(guò)0.22 μm膜于進(jìn)樣瓶中，備超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。
2 結(jié)果與分析
2.1樣品處理結(jié)果
圖 1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)（10 mg/L）譜圖（A）、乳粉樣品譜圖（BB）Fig.1 Mass spectra of taurine standard （10 mg/L） （A） and milk powder sample （B）
乳粉樣品中含有大量的蛋白質(zhì)，給?；撬岬臋z測(cè)帶來(lái)了困難，所以在分析時(shí)首先要除去樣品中的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有的除去蛋白質(zhì)的方法主要有固相萃取法［21-22］和蛋白沉淀法［23-24］。固相萃取法原理是當(dāng)樣液經(jīng)過(guò)固相色譜柱時(shí)，?；撬釋?huì)被固相萃取柱中的固定相保留，而蛋白質(zhì)則隨樣液流出，以達(dá)到分離的目的。該方法具有樣品凈化效率高的優(yōu)點(diǎn)，但固相萃取柱成本較高，凈化步驟較為繁瑣。蛋白沉淀法則是通過(guò)向提取液中加入沉淀劑使蛋白沉淀來(lái)達(dá)到凈化目的，該方法操作簡(jiǎn)便、快捷，因此本實(shí)驗(yàn)使用蛋白沉淀法進(jìn)行樣品處理。
本實(shí)驗(yàn)分別選用了乙腈、硫酸鋅、硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅的混合溶液做為沉淀劑來(lái)去除樣品中的蛋白質(zhì)。采用乙腈作為蛋白沉淀劑，由于?；撬岵蝗苡谝译?，因此部分?；撬釙?huì)隨蛋白一同沉淀，回收率較低，不能滿足檢測(cè)要求；采用硫酸鋅去除蛋白效果較好，經(jīng)硫酸鋅去除蛋白后樣液澄清，且硫酸鋅溶液對(duì)牛磺酸的提取效率較高，但使用該方法對(duì)于含糖量較高的乳粉進(jìn)行處理時(shí)，回收率較低，只有60%左右，因此乙酸鋅作為沉淀劑不適用于含糖乳粉中?；撬岬臋z測(cè)；而采用硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅的混合液作為一種蛋白沉淀劑，利用乙酸鋅與亞鐵氰化鉀發(fā)生反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅沉淀來(lái)挾走或吸附干擾物質(zhì)，可用于乳粉樣品的蛋白沉淀以及可溶性糖類的凈化，因此本實(shí)驗(yàn)選擇硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為沉淀劑達(dá)到了滿意的樣品處理效果。如圖1所示。
2.2質(zhì)譜分析中對(duì)樣品的基質(zhì)效應(yīng)的去除
基質(zhì)效應(yīng)主要表現(xiàn)為使用同一條件進(jìn)行分析時(shí)，相同質(zhì)量濃度的目標(biāo)物質(zhì)在純?nèi)軇┲泻突|(zhì)中的影響存在較大的差異。如圖2所示，將500 μg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一條件下，經(jīng)C18柱分析后，溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液峰形呈高斯分布，響應(yīng)較高，而基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰形很差，不能達(dá)到檢測(cè)要求。主要是因?yàn)榻?jīng)1.3.3節(jié)方法處理后的樣品中含有大量的脂肪類物質(zhì)并未去除，經(jīng)C18色譜柱進(jìn)行分析時(shí)，?；撬岜Ａ糨^弱，與樣液中的脂肪類物質(zhì)同時(shí)被洗脫進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)，降低?；撬岬碾x子化效率，基質(zhì)效應(yīng)比較明顯。
圖2 經(jīng)CC1188色譜柱分析后?；撬峄|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)比譜圖Fig.2 Comparative mass spectra of taurine standard in solvent and matrix after separation on C18column
目前常見(jiàn)的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法一般有加入同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物、優(yōu)化樣品前處理方法、優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件、進(jìn)樣前稀釋、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校準(zhǔn)等。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)優(yōu)化色譜條件（即選擇HILIC色譜柱）來(lái)去除乳粉中脂肪類物質(zhì)對(duì)?；撬岬幕|(zhì)效應(yīng)的影響。HILIC色譜柱采用中性的酰胺鍵合基團(tuán)，利用親水作用色譜原理，對(duì)強(qiáng)極性、水溶性堿性有機(jī)化合物有較好的保留；因此采用HILIC色譜柱對(duì)嬰幼兒乳粉中的?；撬徇M(jìn)行測(cè)定時(shí)，脂肪類物質(zhì)不被HILIC色譜柱所保留率先流出，因此與?；撬嵊休^好的分離，從而有效地去除了基質(zhì)效應(yīng)的影響，能夠達(dá)到乳粉中牛磺酸的檢測(cè)要求，見(jiàn)圖3。
圖 3 經(jīng)HILIC色譜柱分析后?；撬峄|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)譜圖（50000 μgg//LL）Fig.3 Comparative mass spectra of taurine standard in solvent and matrix after separation on HILIC column （500 μgg/L）
2.3質(zhì)譜分析中影響電離因素的優(yōu)化
電噴霧離子源電離技術(shù)的原理是在毛細(xì)管的出口處施加高壓，使從毛細(xì)管流出的液體在高電場(chǎng)中霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑的蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后爆裂為大量的帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，使得被分析的目標(biāo)物以單電荷或多電荷的形式進(jìn)入質(zhì)譜中［25］。
影響電噴霧離子源電離的因素有很多，比如流速、電壓等離子源的設(shè)置，分析物本身的特性，質(zhì)子化物質(zhì)在電噴霧離子源中是低質(zhì)量范圍物質(zhì)干擾的來(lái)源等等。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)霧化器溫度、干燥氣流速以及流動(dòng)相的pH值3 個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)最終確定，最佳的霧化器溫度為300 ℃；最佳的干燥氣流速為7 L/min；流動(dòng)相的緩沖溶液為50 mmol/L乙酸胺。
2.4方法學(xué)考察
2.4.1線性關(guān)系
取?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照逐級(jí)稀釋的原則配制250、200、150、100、50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo)，?；撬豳|(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明在50～250 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=661.2x－27 297，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 0。
2.4.2回收率、精密度、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard devition，RSD）、檢出限
為考察樣品前處理對(duì)?；撬崮繕?biāo)物的凈化提取效率，本實(shí)驗(yàn)平行稱取4 個(gè)乳粉樣品各2 g，一個(gè)做空白，另外3 個(gè)添加1 mg/L?；撬崛芤?0、100、200 μL于50 mL的離心管，使用上述方法測(cè)得?；撬岬募訕?biāo)回收率后每一個(gè)點(diǎn)平行做8 次，測(cè)得精密度，見(jiàn)表3。加標(biāo)回收率在72%～97%范圍，RSD在2.16%～3.33%范圍內(nèi)，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度高，精密度高。依據(jù)此方法，該儀器測(cè)定?；撬岬膬x器檢出限為50 μg/L，該方法檢出限為1 mg/L。
表3 回收率及精密度值Taabbllee 33 RReeccoovveerriieess ooff ttaauurriinnee iinn ssppiikkeedd bbllaannkk ssaammppllee%
2.5樣品分析
表 4 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定嬰幼兒乳粉中牛磺酸的結(jié)果Taabbllee 44 TTaauurriinnee ccoonntteenntt ooff iinnffaanntt mmiillkk ppoowwddeerr ddeetteerrmmiinneedd bbyy UPLC-MMSS//MMSSmg/100 g
在市場(chǎng)上隨機(jī)抽取嬰幼兒乳粉8 批，按照實(shí)驗(yàn)所給的條件測(cè)定乳粉中?；撬岬暮?，測(cè)得的結(jié)果以及樣品標(biāo)示?；撬岷咳绫?所示。結(jié)果表明市場(chǎng)售賣的嬰幼兒乳粉中?；撬岬暮颗c樣品標(biāo)示基本一致，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的限量要求。
3 討論與結(jié)論
在Massimo［18］、Mario［19］等對(duì)?；撬岬难芯恐?，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜與超高效薄層色譜質(zhì)譜方法檢測(cè)能量飲料中?；撬岬暮?。Massimo等［18］對(duì)能量飲料中牛磺酸的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便；Mario等［19］采用柱后衍生法檢測(cè)能量飲料中的牛磺酸，此方法操作較復(fù)雜。但能量飲料相對(duì)于嬰幼兒乳粉，沒(méi)有蛋白質(zhì)和脂肪等大分子雜質(zhì)，處理較方便，甚至可以直接測(cè)定；而嬰幼兒乳粉中的蛋白質(zhì)和脂肪影響樣品的處理過(guò)程，需要一個(gè)適合的方法去除這些雜質(zhì)，以免影響樣品的檢出和靈敏度。本實(shí)驗(yàn)在他們研究成果的基礎(chǔ)上，很好地去除了乳粉中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，建立了一套去除基質(zhì)效應(yīng)、優(yōu)化影響電離因素，快速、高效的測(cè)定嬰幼兒乳粉中?；撬岬姆椒?。
本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定嬰幼兒乳粉中的牛磺酸，樣品前處理用硫酸亞鐵氰化鉀和乙酸鋅去除蛋白，并離心過(guò)膜去除雜質(zhì)；方法對(duì)樣品的凈化效果好，操作簡(jiǎn)便，快速。采用HILIC色譜柱進(jìn)行樣品檢測(cè)，可以有效地降低基質(zhì)效應(yīng)，整個(gè)檢測(cè)在8.0 min內(nèi)完成。色譜條件便于掌握，檢出限低；結(jié)果準(zhǔn)確度高，靈敏度高，對(duì)于同時(shí)進(jìn)行大批量樣?jì)胗變喝榉壑信；撬岬臋z測(cè)有重要意義。
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Direct Determination of Taurine in Infant Milk Powder by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
CHEN Xiaofeng1， ZHOU Wei2，*， XIE Yingshuang2
（1. College of Geography and Environmental Science， Northwest Normal University， Lanzhou730070， China；
2. Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Lanzhou730010， China）
Ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was applied for the direct determination of taurine in infant milk powder. The sample pretreatment procedure was optimized， and the matrix effect and the factors influencing electrospray ionization （ESI） were evaluated to establish a simple， rapid， low-matrixeffect and sensitive method for determining taurine. The results showed that the recovery rate of this method was between 72% and 97%， with relative standard deviation ranging from 2.16% to 3.33%. The instrument detection limit was 50 μg/L，and the method detection limit was 1 mg/L. Quantifi cation using an external standard method could meet the requirements of the European Union and China for taurine detection in infant milk powder. The whole analysis can be accomplished in 8 minutes， and is suitable for the determination of taurine in mass detection of infant milk powder.
ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； matrix effects；baby milk powder； taurine
TS252.7
A
1002-6630（2015）24-0280-06
10.7506/spkx1002-6630-201524052
2015-04-01
陳曉峰（1990—），男，碩士研究生，主要從事環(huán)境監(jiān)測(cè)研究。E-mail：ghty0794@foxmail.com
周圍（1953—），男，研究員，博士，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)及食品安全分析研究。E-mail：zhouwei845@163.com
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