劉念等

摘要：水下固形物表面微生物的黏附生長是生物污損層形成的初級階段。從長江水體分離得到3株淡水黏附菌，并對其形態(tài)特征、生長黏附特性、16S rDNA基因序列和量子點(diǎn)標(biāo)記進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示，3個(gè)菌株在玻片上迅速黏附，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)生長旺盛。菌落和菌細(xì)胞均具有相似的形態(tài)特征，菌落球形突起，厚實(shí)，圓潤光滑，邊緣清晰，顏色有差異，且隨培養(yǎng)基成分而有所改變。胞體呈短桿狀，天然水體培養(yǎng)基上生長較緩慢，菌落形態(tài)有所不同，但仍能很好生長。天然流動(dòng)水體完全可提供這些菌株生長所需養(yǎng)分，在固形物表面迅速黏附生長。

關(guān)鍵詞：淡水黏附菌；形態(tài)特征；細(xì)菌生長；量子點(diǎn)標(biāo)記

中圖分類號(hào)：Q93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）12-2882-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.018

Separation and Observation of Bacteria in Biofouling Biocoenosis

LIU Nian，XIONG Yan-fei， PENG Jun-jiang，XU Han-zhi，LIAO Li-jing，CAI Xiao-yu， XU Yun

（Institute of Biological Sciences and Technology，Wuhan University of Technology， Wuhan 430070， China）

Abstract：It is the first stage of bio-fouling layer formation when microorganisms stick to the solid surface underwater. We separated three bacterias from the Yangtze River， and first studied their morphological character， character of growth and adhesion， 16S rDNA gene-base phylogenetic， and quantum dot labeling. Results show that three strains can stick to glass quickly， and grow fast under lab culture condition. Bacteria colony and cell all have similar morphological character； a colony is globular， thick， smooth and has clear edge. But the colors of three strains are different， changing with culture medium. Single bacterium is short rod shaped；poor growth rate in natural water medium is observed； the colony morphology looks different， but still can grow well. Natural river condition can provide enough nutrients to perfectly ensure the fast growth and adhesion on the solid surface.

Key words： freshwater adhesion of bacteria； morphological character； growth of bacteria； quantum dot labeling

在海洋環(huán)境中，海洋生物依附于船舶表面和海洋水下設(shè)施生長，造成海洋生物污損[1]。研究表明，海洋生物污損過程可分為4部分，分別是基膜的形成、微生物膜的形成、海藻孢子和原生動(dòng)物的附著、大型污損生物的附著。形成基膜的有機(jī)分子或無機(jī)顆粒最開始是簡單的物理吸附過程，隨著環(huán)境的變化吸附與脫附持續(xù)進(jìn)行[2]。最先附著的微生物的生長會(huì)增加表面的粗糙度和疏水性[3]，細(xì)菌通過產(chǎn)生多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂類，形成的胞外基質(zhì)將自己包裹而得到保護(hù)[4]，生物膜形成后很難清除。防垢層表面的有機(jī)物又能作為微生物再生長的碳源[5]，進(jìn)一步引導(dǎo)海綿、水螅、海藻、石灰蟲以及藤壺、貝類等次級生物附著。生物污損是不可逆的，給航運(yùn)、海防及水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失和安全隱患。

量子點(diǎn)是一種具有納米尺寸的半導(dǎo)體晶體。與傳統(tǒng)的熒光染料相比，量子點(diǎn)擁有許多獨(dú)特的光學(xué)特性，如寬的吸收譜、窄而對稱的發(fā)射譜、耐漂白、亮度高和熒光壽命長等。由于其出色的光物理特性和相對較小的尺寸，量子點(diǎn)可作為生物學(xué)研究的熒光探針[6]。本研究對長江水體黏附細(xì)菌的分離、鑒定以及不同條件下的生長及細(xì)菌量子點(diǎn)標(biāo)記等進(jìn)行論述，研究了分離的淡水黏附菌的基本特性，摸索了水溶性ZnO量子點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)菌的標(biāo)記方法，為后期進(jìn)一步研究生物污損群落中細(xì)菌的附著生長及抑制附著的因素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

對照菌：大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）由武漢大學(xué)微生物保藏中心提供。

實(shí)驗(yàn)菌：取自長江水域。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，3種以江水及其內(nèi)容物為營養(yǎng)源的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基Ⅰ為同水域江水經(jīng)8層紗布與3層脫脂棉組合過濾后加瓊脂滅菌，培養(yǎng)基Ⅱ?yàn)橥蚪o置后虹吸上清液加瓊脂滅菌，培養(yǎng)基Ⅲ為同水域江水與少量水下生物污損層固形物混勻后加瓊脂滅菌）。

量子點(diǎn)：ZnO量子點(diǎn)水溶液由武漢理工大學(xué)材料學(xué)院王藝峰老師提供。

主要試劑：十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，其他常用試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌的分離培養(yǎng)與純化 在長江武漢段黃鶴樓輪渡引橋水線下約20 cm處懸掛滅菌載玻片，分別于0.5、1、2、6、24 h取出實(shí)驗(yàn)菌，采用影印法，將載玻片上菌體印跡至牛肉膏蛋白胨固體平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察比較掛片不同時(shí)長后玻片黏附菌的數(shù)量及種類。選取優(yōu)先黏附、數(shù)量較多的3種菌落，平板劃線法進(jìn)行多次分離純化，獲得3個(gè)主要菌株，根據(jù)菌落顏色分別命名為AB-w（Adhesion bacteria—white）、AB-y（Adhesion bacteria—yellow）、AB-ly（Adhesion bacteria—light yellow），作為實(shí)驗(yàn)菌株。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)菌的生長及菌落觀察 3種實(shí)驗(yàn)菌分別在培養(yǎng)基Ⅰ、培養(yǎng)基Ⅱ、培養(yǎng)基Ⅲ上，于實(shí)驗(yàn)室條件下，37 ℃培養(yǎng)，作菌落形態(tài)觀察，與富營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長菌落比較。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)菌生長曲線測定 挑取經(jīng)37 ℃活化24 h的牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面保種的實(shí)驗(yàn)菌兩環(huán)，接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min培養(yǎng)20 h，作為實(shí)驗(yàn)用菌液。上述菌液以1%接種量接種于costar 3599型無菌帶蓋96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，設(shè)置8個(gè)平行，37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min，酶標(biāo)儀測定630 nm處的吸光值（OD），繪制生長曲線。

1.2.4 菌體形態(tài)觀察 對實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。以金黃色葡萄球菌或大腸桿菌混合涂片染色作進(jìn)一步對照。

1.2.5 菌株AB-w的DNA提取、序列擴(kuò)增測定及比對 挑取菌體于50 μL的TaKaRa可直接用于PCR的微生物裂解緩沖液（Code No.9164）中，80 ℃、15 min變性后離心取上清作為模板。使用TaKaRa 16S rDNA細(xì)菌鑒定PCR試劑盒（Code No.RR176），進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min，一個(gè)循環(huán)；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，一個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，使用TaKaRa瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒（Code No.9762）切膠回收目的片段進(jìn)行DNA測序，由大連寶生物工程有限公司完成。獲得序列進(jìn)行Blast搜索。

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育分析來源有約翰不動(dòng)桿菌（A.johnsonii，Z93440）、溶血不動(dòng)桿菌（A.haemolyticus，Z93437）、沃氏不動(dòng)桿菌（A.lwoffii，U10875）、鮑曼不動(dòng)桿菌（A.baumannii，HE978267，HE651907）、瓊氏不動(dòng)桿菌（A.junii，ABl01444）以及醋酸鈣不動(dòng)桿菌（A.calcoaceticus，AFl59045）。外群為莫拉氏菌（Moraxella lacunata，AF005165）[7]。應(yīng)用軟件MEGA6鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 SDS對實(shí)驗(yàn)菌生長及黏附的影響 實(shí)驗(yàn)操作參照前述1.2.3進(jìn)行，添加SDS至濃度分別為0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，設(shè)置4個(gè)平行。培養(yǎng)至46 h后去培養(yǎng)液，加入100 μL結(jié)晶紫染色液染色1 min，去染色液，無菌去離子水洗去殘留染液，加入200 μL無水乙醇，37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min抽提10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光值。

1.2.8 ZnO量子點(diǎn)水溶液標(biāo)記實(shí)驗(yàn)菌及黏附情況觀察 挑取經(jīng)37 ℃活化24 h的牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面保種的實(shí)驗(yàn)菌兩環(huán)，接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min培養(yǎng)3 h，離心去上清液，菌體以少量新鮮液體培養(yǎng)基充分懸浮。分別取20 μL涂片，火焰固定，充分水洗。

無菌EP管中依次加入菌懸液500 μL，ZnO量子點(diǎn)水溶液200 μL，PBS（pH 7.4）200 μL，EDC（0.1 mol/L）100 μL[8]，混勻后37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min培養(yǎng)30 min，對實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行標(biāo)記。結(jié)束后取20 μL涂片，火焰固定，充分水洗。

另取無菌玻璃培養(yǎng)皿（90 mm），將無菌玻璃片以無菌瓊脂緊貼于側(cè)壁，加入15 mL新鮮液體培養(yǎng)基，分別加入200 μL經(jīng)ZnO量子點(diǎn)標(biāo)記的3種實(shí)驗(yàn)菌中的2種，另一種實(shí)驗(yàn)菌未標(biāo)記，37 ℃恒溫空氣搖床100 r/min培養(yǎng)30 min，去培養(yǎng)液，無菌去離子水15 mL分3次洗滌培養(yǎng)皿，鑷子取出玻璃片，擦鏡紙擦去底面殘余瓊脂，1 mL滅菌去離子水清洗玻璃片，火焰固定，充分水洗。OLYMPUS IX71型倒置熒光顯微鏡紫外激發(fā)下觀察熒光。

2 結(jié)果及分析

2.1 實(shí)驗(yàn)菌的分離培養(yǎng)

從長江武漢段江水中懸掛蓋玻片上影印培養(yǎng)得到大量菌落，如圖1所示。

懸掛0.5 h的玻片上即有大量菌體附著，可見不同顏色菌落，以白色居多，大小不一。隨著時(shí)間延長附著菌體迅速增加，24 h即可覆滿整個(gè)玻片表面，菌落細(xì)小，密集、整體呈黃色，難以區(qū)分不同菌落。0.5 h懸片印跡生長的菌落，菌落均突起，不透明，圓形，表面光滑、濕潤，從大小及顏色上至少可區(qū)分有3個(gè)主要菌落，經(jīng)進(jìn)一步分離純化，得3種菌株，分別記為AB-w、AB-y、AB-ly。

自然環(huán)境條件下，養(yǎng)分供應(yīng)相對缺乏，溫度較低，細(xì)菌生長會(huì)緩慢一些。掛片取樣時(shí)，前6 h主要為菌體的附著過程，在玻片表面，菌體附著迅速，見圖1。0.5 h即開始有菌體黏附，至6 h時(shí)幾乎覆蓋了整個(gè)玻片表面，但菌體的黏附似乎并不是完全隨機(jī)的，從圖1的a至d，菌體并非均勻分布于玻片表面，而是較傾向于聚集成片，即已黏附菌體對后續(xù)菌體的黏附有一定的引導(dǎo)作用，對此，將進(jìn)一步觀察研究。

2.2 實(shí)驗(yàn)菌的生長及菌落觀察

AB-w、AB-y、AB-ly在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長迅速，24 h即可形成飽滿圓潤直徑約2 mm的菌落，60 h后菌落直徑約3～4 mm，菌落顏色明顯（圖2）。AB-w菌落白色，圓潤，呈球形突起，表面光滑；AB-y菌落黃色，形態(tài)與AB-w相似；AB-ly菌落淺土黃色，形態(tài)與AB-w相似。劃線邊緣處菌落均明顯較密集區(qū)菌落大，說明營養(yǎng)充足時(shí)均能很好地生長。

在以江水及其內(nèi)容物作為營養(yǎng)源的培養(yǎng)基上，3個(gè)菌株生長明顯要緩慢。培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)基Ⅰ上可見AB-w形成微小菌落，AB-y和AB-ly未見明顯生長。培養(yǎng)至60 h，3個(gè)菌落均肉眼可見，但菌落大小、顏色和形態(tài)均有著明顯的變形（圖3）。AB-w菌落直徑約0.2～0.3 mm，略透明，邊緣較整齊光滑，顏色不明顯；AB-y菌落直徑約0.1～0.2 mm，圓形或近圓形，中部凸起，邊緣較不整齊，略透明；AB-ly菌落直徑約0.5～1.0 mm，邊緣不規(guī)則，圓形或近橢圓形，鋪展，透明。相較于培養(yǎng)基Ⅰ上，3個(gè)菌株在培養(yǎng)基Ⅱ上形成的菌落均較厚實(shí)，略大，質(zhì)地較不均勻，中部略凹陷，應(yīng)為營養(yǎng)相對缺乏的原因。在培養(yǎng)基Ⅲ上，3個(gè)菌株生長水平又稍有提高，菌落明顯變大，形態(tài)更加接近球狀，顏色特征依然不明顯。可見，在營養(yǎng)相對缺乏的天然水體環(huán)境中，3個(gè)菌株仍可較好地生長，其中，以AB-w生長最為迅速，菌落較大，數(shù)量最多，為水體中的優(yōu)勢菌種。天然流動(dòng)水體中的營養(yǎng)物質(zhì)完全可滿足這些菌株迅速生長，為次級附生生物提供養(yǎng)分。

2.3 實(shí)驗(yàn)菌的生長曲線測定

圖4為實(shí)驗(yàn)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的生長曲線。由圖4可見，由于接種采用的是液體培養(yǎng)物，前后培養(yǎng)環(huán)境差異不大，實(shí)驗(yàn)條件下，細(xì)菌分裂迅速，對數(shù)期可持續(xù)5～16 h。在前5 h，AB-w生長迅速，之后相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)處于穩(wěn)定期，至46 h依然無明顯下降趨勢；AB-y與AB-ly曲線類似，前16 h生長較好，穩(wěn)定期較短約為8 h，之后明顯下降。

2.4 菌體形態(tài)及革蘭氏染色鑒定

菌株AB-w、AB-y、AB-ly與金黃色葡萄球菌或大腸桿菌混合革蘭氏染色結(jié)果見圖5。AB-w革蘭氏陰性，桿狀，長2～3 μm，寬1～3 μm，長寬比接近1.4∶1（圖5a）；AB-y革蘭氏陽性，桿狀，菌體長3～5 μm，寬2 μm左右，長寬比接近2.1∶1（圖5b）；AB-ly革蘭氏陰性，桿狀，菌體長3～4 μm，寬2 μm左右，長寬比接近1.5∶1（圖5c）。3種菌體形態(tài)上具有明顯的共同特征，胞體短桿狀，較大腸桿菌大。

2.5 16S rDNA 基因序列分析

將擴(kuò)增得到的16S rDNA基因電泳檢測，測得其序列長度為1 451 bp。經(jīng)Blast序列分析，結(jié)果表明細(xì)菌AB-w與不動(dòng)桿菌同源性最高。從GenBank中調(diào)取與細(xì)菌AB-w同源性較高的菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），結(jié)果顯示，AB-w與鮑曼不動(dòng)桿菌（A.baumannii）在同一分支中，一致性達(dá)到了100%。根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA基因序列分析，鑒定細(xì)菌AB-w為鮑曼不動(dòng)桿菌（A.baumannii）。

2.6 SDS對實(shí)驗(yàn)菌抑制生長及促進(jìn)黏附作用

不同濃度的SDS對3種實(shí)驗(yàn)菌都有明顯的抑制生長的效果，SDS能在短時(shí)間內(nèi)控制實(shí)驗(yàn)菌的生長（圖7）。結(jié)晶紫染色后可明顯觀察到與未添加SDS組相比，添加SDS不能明顯減少實(shí)驗(yàn)菌的黏附，此現(xiàn)象在前期采用玻璃片作為實(shí)驗(yàn)菌黏附對象，采用印跡計(jì)數(shù)菌落時(shí)也出現(xiàn)過。

2.7 量子點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)菌的標(biāo)記效果及標(biāo)記實(shí)驗(yàn)菌黏附分析

經(jīng)處理的ZnO量子點(diǎn)能一定程度上標(biāo)記實(shí)驗(yàn)菌，單獨(dú)處理一種實(shí)驗(yàn)菌，計(jì)數(shù)不同顯微視野下的標(biāo)記率可以達(dá)到51%～99%，波動(dòng)較大；同時(shí)標(biāo)記2種實(shí)驗(yàn)菌，另一種未標(biāo)記，將3種菌混合培養(yǎng)，對熒光及明場下玻璃表面的黏附菌體數(shù)量進(jìn)行比較，同樣存在標(biāo)記率波動(dòng)較大的現(xiàn)象。AB-w未標(biāo)記組，標(biāo)記率在27.4%～79.0%；AB-y未標(biāo)記組，標(biāo)記率在38.2%～88.3%；AB-ly未標(biāo)記組，標(biāo)記率在38.0%～78.3%。相比而言革蘭氏陰性菌似乎更易被標(biāo)記。單一實(shí)驗(yàn)菌標(biāo)記如圖8所示。

3 小結(jié)與討論

從長江水體分離得到3株淡水黏附菌，在玻片上粘附迅速，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)生長旺盛。菌落和菌細(xì)胞均具有相似的形態(tài)特征，菌落球形突起，厚實(shí)，圓潤光滑，邊緣清晰，顏色有差異，且隨培養(yǎng)基成分而有所改變。胞體呈短桿狀，AB-w與AB-ly革蘭氏染色陰性，AB-y革蘭氏染色陽性。天然水體培養(yǎng)基上生長較緩慢，菌落形態(tài)有所不同，主要表現(xiàn)為營養(yǎng)缺乏時(shí)，菌落沿培養(yǎng)基鋪展生長。天然流動(dòng)水體中完全可提供這些菌株生長所需養(yǎng)分，特別是在春夏季，這些菌株可在水中固形物表面迅速黏附生長，促進(jìn)次級附生生物的附著生長，形成生物污損層，造成生物腐蝕。

對AB-w進(jìn)行了16S rDNA基因序列分析，其測試結(jié)果顯示為鮑曼不動(dòng)桿菌，與該菌的革蘭氏染色結(jié)果與強(qiáng)黏附性相一致。學(xué)者針對鮑曼不動(dòng)桿菌的研究主要針對其耐藥性[9，10]，未有系統(tǒng)研究其強(qiáng)黏附作用與生物污損的關(guān)系。

低濃度的SDS溶液即可快速而顯著地控制實(shí)驗(yàn)菌的生長，由于SDS溶液易起泡，加樣時(shí)難免產(chǎn)生少許氣泡，氣泡雖然可以在4 h內(nèi)全部消除，但仍然會(huì)對前期測量產(chǎn)生一定的影響。細(xì)菌生長受到抑制的情況下，其黏附結(jié)果受影響不大，甚至黏附量增多，其原因還待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)條件下，水溶性ZnO量子點(diǎn)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)菌的效果一般，其中AB-w與AB-ly兩種革蘭氏陰性菌標(biāo)記效果相對較好，革蘭氏陽性菌AB-y效果較差。采用金黃色葡萄球菌與大腸桿菌作為被標(biāo)記物時(shí)，結(jié)果同樣如此。更適合的標(biāo)記條件與標(biāo)記質(zhì)量的影響因素待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] YEBRAD M，KIIL S，JOHANSEN K D. Antifouling technology-past，present and future steps towards efficient and environmentally friendly antifouling coatings[J]. Progress in Organic Coatings，2004，50（2）：75-104.

[2] WALLSTROM E，JESPERSEN H T，SCHAUMBRUG K. A new concept for anti-fouling paint for Yachts[J]. Progress in Organic Coatings，2011，72（1）：109-114.

[3] PASMORE M， TODD P， SMITH S， et al. Effects of ultrafiltration membrane surface properties on Pseudomonas aeruginosa biofilm initiation for the purpose of reducing biofouling[J]. Journal of Membrane Science，2001，194（1）：15-32.

[4] FLEMMING H C，WINGENDER J. The biofilm matrix[J]. Nature Reviews Microbiology，2010，8（9）：623-633.

[5] VANDER HOEK J P，HOFMANJ AMH，BONN？魪 PAC，et al. RO treatment： Selection of a pretreatment scheme based on fouling characteristics and operating conditions based on environmental impact[J]. Desalination，2000，127（1）：89-101.

[6] 王曉暄，曲 峰，陳祖彬，等.用量子點(diǎn)標(biāo)記活細(xì)胞[J].生物物理學(xué)報(bào)，2010，26（5）：365-372.

[7] 顧澤茂，柳 陽，陳昌福，等.鮑曼不動(dòng)桿菌斑點(diǎn)叉尾鮰株的分離與鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（4）：489-493.

[8] 蔡朝霞，阮曉娟，石寶琴，等.水溶性CdSe量子點(diǎn)的合成及其作為熒光探針對大腸桿菌的快速檢測[J].分析試驗(yàn)室，2011， 30（3）：107-110.

[9] 游 洋，顧偉杰，王 錚，等.鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成與耐藥的相關(guān)性初探[J].中國病原生物學(xué)雜志，2012，7（7）：500-502.

[10] 張銀旺.鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及耐藥譜分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，24（10）：1507-1514.