李　　萍，楊秋輝，王俊嶺，江智龍

吡菲尼酮對牛血清蛋白誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝損害的保護(hù)作用觀察*

李萍，楊秋輝，王俊嶺，江智龍

【摘要】目的探討吡菲尼酮對牛血清蛋白誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的影響。方法雄性Wistar大鼠30只被隨機(jī)分為3組，給予模型組腹腔注射牛血清白蛋白，正常對照組接受等量的生理鹽水腹腔注射，治療組在腹腔注射牛血清白蛋白5 w后，按200 mg·kg-1·d-1灌胃給藥吡菲尼酮，治療4 w后處死試驗動物，留取肝臟組織，行HE和Masson染色，觀察肝臟病理學(xué)改變，采用免疫組化法檢測Smad6蛋白表達(dá)。結(jié)果與模型組比，吡菲尼酮治療組肝組織纖維化S3和S4期病變較模型組明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，膠原纖維間隔縮小，著色變淺；模型組肝組織Smad6相對表達(dá)量為（108.2±33.6），顯著低于吡菲尼酮治療組［（329.4±39.2），P＜0.05］。結(jié)論吡菲尼酮可抑制牛血清蛋白誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，其機(jī)制與通過上調(diào)Smad 6蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肝纖維化；吡菲尼酮；Smad6；大鼠

目前，臨床上仍然缺乏有效的治療肝纖維化的手段。研究發(fā)現(xiàn)吡啶酮類化合物能預(yù)防和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的產(chǎn)生，在肺和腹膜纖維化的防治方面顯示出良好的效果［1，2］。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)5-甲基-2-（1H）吡啶酮類化合物是一類有抗肝纖維化作用的藥物，在這類化合物中，目前研究較多的是吡菲尼酮（pirfenidone，PF），其化學(xué)結(jié)構(gòu)為1-苯基-5-甲基-2-（1H）吡啶酮［3］。國內(nèi)外絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵，抑制HSC的激活對肝纖維化的防治有重要價值［4，5］。既往的研究多集中在抑制HSC增殖方面。近年研究顯示HSC激活過程中存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial mesenchymal transition，EMT）［6］。這一新理論使抗肝纖維化有了新的靶點。本研究通過動物模型，探討了吡菲尼酮的抗肝纖維化作用。

1　材料與方法

1.1動物與試劑30只清潔級雄性Wistar大鼠［動物合格證號：scxk（京）2007-0001］，體質(zhì)量120～150 g，動物室溫度26～28℃，濕度68%～72%，墊料干燥，自由進(jìn)食、飲水，食料中蛋白含量為20%。牛血清白蛋白（BSA）購自上海索萊寶公司；弗氏不完全佐劑、羊毛脂、液體石臘均購自天津化學(xué)試劑二廠；骨形態(tài)發(fā)生蛋白 -7（bonemorphogeneticprotein-7，BMP-7）、Smad6免疫組化檢測試劑盒，一抗（鼠IgG），二抗（羊抗鼠IgG），抗原修復(fù)液I，山羊血清封閉液均由武漢博士德生物工程有限公司提供；SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒均來自武漢博士德生物工程有限公司；Masson染色液，95%、85%、75%乙醇由無水乙醇加蒸餾水按梯度配制，3%雙氧水由30%雙氧水加蒸餾水配制而成。0.01M枸櫞酸鹽緩沖液、0.01M PBS液均來自武漢博士德。

1.2肝纖維化模型的制備用5%苦味酸將30只大鼠編號，并隨機(jī)分為正常對照組（N）10只、模型組（M）10只和吡菲尼酮處理組（A）10只。在模型組、吡菲尼酮處理組，先用18 mg/ml牛血清白蛋白生理鹽水溶液與等體積弗氏不完全佐劑乳化液行皮下多點致敏注射，每次0.5 mL/只，共5次。第1、2次間隔2 w，以后間隔1 w。在末次注射后1 w，給予牛血清白蛋白腹腔注射，2次/w，共16次。自5mg開始，每2w增加1mg。在正常對照組，接受等量的生理鹽水腹腔注射；在模型組，按計劃腹腔注射牛血清白蛋白和等量的生理鹽水腹腔注射；在吡菲尼酮處理組，自腹腔注射牛血清白蛋白5 w后開始，給予吡菲尼酮200 mg. kg-1.d-1灌胃，共治療4 w。在實驗結(jié)束時，給予大鼠10%水合氯醛5 ml腹腔注射，麻醉。由腹正中線切皮，進(jìn)入腹腔，暴露膈肌，自膈肌下用10 ml注射器經(jīng)心臟取血。充分暴露和游離肝臟，將大鼠肝臟一次性取出，置托盤中稱質(zhì)量。從不同肝葉取兩塊肝組織，每塊約1×1×0.5 cm，分別置入組織固定液和10%中性甲醛中固定。后者經(jīng)石臘包埋，切片5μm，行HE染色，封片，鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變。取出經(jīng)組織固定液固定的肝組織，經(jīng)脫水，透明，石蠟包埋，4 μm切片，置入60℃溫箱過夜，趁熱放入二甲苯溶液Ⅰ和Ⅱ中各5 min，梯度脫水，3%過氧化氫甲醇溶液消化18 min，蒸餾水洗3次，蘇木素染液染5 min，流水洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗至藍(lán)黑色，置麗春紅酸性品紅染液中染色5 min，蒸餾水洗，1%磷鉬酸溶液處理5 min，置苯氨藍(lán)溶液中染色5 min，蒸餾水洗，1%冰醋酸處理1 min，95%酒精分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠固定。在普通光鏡下觀察，參照2000年中華醫(yī)學(xué)會修訂的病毒性肝炎防治方案［7］的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肝組織纖維化分期。

1.3肝組織Smad 6蛋白檢測肝組織標(biāo)本用10%甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，采用SABC法行免疫組化染色。具體：將石蠟切片脫蠟、脫水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，浸入煮沸的溶液中，繼續(xù)加熱至高溫高壓狀態(tài)下持續(xù)2 min，自然冷卻，蒸餾水漂洗。加正常山羊血清封閉液覆蓋組織，置于37℃恒溫箱中30 min。分別滴加抗Smad 6（1：100），37℃孵育30 min，4℃過夜，取出后PBS沖洗，加生物素二抗，37℃，恒溫30 min。PBS沖洗。加親和素-過氧化酶溶液37℃ 20 min，PBS沖洗，蒸餾水漂洗。加DAB顯色劑，抹片后滴加顯色劑，鏡下控制顯色時間，蒸餾水沖洗，終止染色。蘇木素復(fù)染1 min，蒸餾水沖洗，乙醇脫水，風(fēng)干后中性樹膠封片，鏡檢，并照相記錄。為保證實驗結(jié)果的可靠性，特別是免疫組化的特異性，用PBS代替一抗作陰性對照。在全自動圖像分析儀（HMIAS-2000彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)）下計算Smad 6陽性信號，并以此反映該樣本中Smad 6的相對含量。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理計量資料以（x±s）表示，采用One-way ANOVA分析，進(jìn)一步采用最小顯著差值法（LSD）分析實驗組與對照組的差異。采用Ridit分析肝組織病理學(xué)資料，以P＜0.05為差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肝組織病理學(xué)表現(xiàn)模型組較吡非尼酮治療組肝臟表面粗燥，質(zhì)地較硬，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤明顯，肝細(xì)胞壞死灶較多。膠原染色可見模型組匯管區(qū)-中央靜脈區(qū)有寬大的纖維間隔，可見假小葉形成，比吡非尼酮治療組明顯，而吡非尼酮治療組炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，膠原纖維間隔縮小，著色變淺。模型組較吡非尼酮治療組S3和S4明顯增多（P＜0.05，表1、表2、圖1～3）。

表1　各組肝組織纖維化分期比較

表2　各組肝組織炎癥分級比較

圖1　模型組肝組織學(xué)表現(xiàn)　匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤明顯，大量肝細(xì)胞壞死灶（HE，100×）

圖2　吡非尼酮治療組肝組織學(xué)表現(xiàn)　匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤減少，無明顯的肝細(xì)胞壞死（HE，100×）

圖3　正常對照組肝組織學(xué)表現(xiàn)　匯管區(qū)無炎癥細(xì)胞浸潤，無明顯的肝細(xì)胞壞死（HE，100×）

2.2肝組織Smad 6蛋白表達(dá)情況在模型組肝纖維化組織中Smad 6表達(dá)少，主要分布在血竇壁、竇周細(xì)胞、壞死灶和匯管區(qū)的非實質(zhì)細(xì)胞、膽管內(nèi)皮細(xì)胞和纖維化組織中活化的肝星狀細(xì)胞；在吡非尼酮治療組，Smad 6表達(dá)明顯（圖4～6，表3）。

圖4　模型組肝組織Smad 6表達(dá)情況　箭頭所指為Smad 6陽性表達(dá)（ABC，100×）

圖5　吡非尼酮治療組肝組織Smad 6表達(dá)情況箭頭所指為Smad 6陽性表達(dá)（ABC，100×）

圖6　正常對照組肝組織Smad 6表達(dá)情況陰性（ABC，100×）

表3　各組大鼠肝組織Smad 6蛋白相對表達(dá)量（x±s）

3　討論

吡非尼酮在抑制肝纖維化方面的研究主要包括三個方面：1.在動物實驗方面，多采用中毒性和膽汁淤積性肝纖維化動物模型［8］，發(fā)現(xiàn)吡非尼酮通過下調(diào)前膠原alpha1（I）和調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2）與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP-1）平衡起到抗大鼠肝纖維化作用［9，10］；2.在細(xì)胞實驗方面，研究顯示吡非尼酮能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖［11］；3.研究還顯示吡非尼酮有抗內(nèi)毒素的作用［12，13］。

目前，國內(nèi)外絕大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，HSC激活是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵，抑制HSC的激活對肝纖維化的防治有重要價值［4，14］。既往的研究多集中在抑制HSC增殖方面。

近年研究顯示，在HSC激活過程中存在EMT現(xiàn)象［6，15］。這一新理論的提出使抗肝纖維化有了新的靶點。研究顯示在成熟的組織上皮細(xì)胞，在炎癥和創(chuàng)傷的壓力下，經(jīng)過EMT，可致纖維母細(xì)胞的產(chǎn)生和纖維化的形成［16～18］。在胚胎期，HSC是內(nèi)皮起源的。在HSC活化過程中存在EMT。一些研究也令人鼓舞地發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（bonemorphogeneticprotein，BMP-7）可以逆轉(zhuǎn)小管上皮細(xì)胞EMT過程，進(jìn)而能減輕已形成的纖維化［19，20］。目前，通過BMP-7途徑抗肝纖維化是一種新的有前景的抗纖維化的靶點［20］。

BMP是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β超家族的一員。BMP-7又稱成骨蛋白 -1（osteogenic protein-1，0P-1）。近年來，動物實驗發(fā)現(xiàn)某些腎臟病的發(fā)生與BMP-7減少有關(guān)，而應(yīng)用BMP-7治療則可減輕腎臟損害，具有抗纖維化作用。BMP-7受體有Ⅰ型ALK-2和Ⅱ型ActR II兩種，兩者是絲氨酸-蘇氨酸跨膜蛋白激酶受體。BMP-7首先與Ⅱ型受體結(jié)合，隨后誘導(dǎo)Ⅰ型和Ⅱ型受體低聚反應(yīng)，形成Ⅰ型和Ⅱ型受體之間的異二聚體。在Ⅱ型受體作用下，Ⅰ型受體被磷酸化而活化。在Ⅰ型受體作用下，胞質(zhì)內(nèi)的信號分子Smad 1、5、8磷酸化，并與Smad 4結(jié)合，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。整個信號傳導(dǎo)過程是通過Smad蛋白啟動信號傳導(dǎo)，形成有活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)不同靶基因的轉(zhuǎn)錄。BMP-7信號復(fù)合體與其他生長因子的信號分子之間似乎也存在著重要的聯(lián)系，如BMP-7可上調(diào)Smad 6或 Smad 7蛋白的表達(dá)，同時Smad 6或 Smad 7蛋白也抑制TGF-β信號傳導(dǎo)，抑制其靶基因的轉(zhuǎn)錄。

由于器官纖維化的發(fā)生機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，對TGF-β1/Smad信號途徑研究較為深入，而對BMP7/Smad信號途徑研究才剛剛開始。我們試圖從BMP7/ActRII/ALK-2/Smad信號途徑研究吡菲尼酮的作用機(jī)制，以發(fā)現(xiàn)其是否具有抑制HSC的EMT現(xiàn)象，也同時探索HSC在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的新的機(jī)制。

抑制型Smad蛋白（inhibitory Smads，I-Smads）包括Smad 6和Smad7，是TGFβ信號的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，在TGFβ信號通路的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。TGFβ家族主要通過Smad蛋白傳遞信號，所形成的信號通路廣泛參與其它信號通路之間的交流，并在不同層面上受到多種精確的調(diào)控。

本研究成功構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，觀察吡菲尼酮對肝纖維化的逆轉(zhuǎn)作用。研究顯示吡菲尼酮可以通過上調(diào)Smad 6蛋白的表達(dá)，這一抗纖維化的新機(jī)制有可能被用于臨床。BMP-7可上調(diào)Smad 6蛋白的表達(dá)，同時Smad 6蛋白也抑制TGF-β 的信號傳導(dǎo)，抑制纖維化靶基因的轉(zhuǎn)錄，為新藥的研制和后續(xù)的研究奠定了一定的基礎(chǔ)，其意義是深遠(yuǎn)的。

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（收稿：2014-07-14）（本文編輯：陳從新）

第一作者：李萍，女，41歲，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師。主要從事病毒性肝炎的診斷與治療學(xué)研究。E-mail：tjlplxg@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.016

*基金項目：天津市衛(wèi)生局（編號：06ky17）

作者單位：300192天津市第二人民醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合二科/天津市肝病醫(yī)學(xué)研究所（李萍）；天津醫(yī)科大學(xué)（楊秋輝，王俊嶺）；天津中醫(yī)藥大學(xué)（江智龍）

Inhibition of hepatic fibrosis induced by bovine serum albumin by pirfenidonein rats Li Ping，Yang Qiuhui，Wang Junling，et al.Second People’s Hospital，Tianjin 301900，China

【Abstract】Objective To investigate the impact of pirfenidone on liver fibrosis induced by bovine serum albumin （BSA）in rats and its relevant mechanism.Methods 30 male Wistar rats were randomly divided into three groups:e.g.in control group the rats were given saline intraperitoneally，in model group were given BSA intraperitoneally，and in treatment group were given intragastric administration of pirfenidone at the dose of 200 mg.kg-1.d-1after 5-week intraperitoneal injection of BSA.The animals were sacrificed after 4-week treatment and the liver specimens were collected.Hepatic pathology was performed by haematoxylin-eosin stain and Masson trichrome stain，and the expression of Smad 6 was detected by immunohistochemistry.Results As compared with in model group，the number of cases with liver fibrosis stage of S3-S4 in treatment group decreased，with significantly reduced infiltration of inflammatory cells，narrowed fibrous septum in liver tissues.Relative expression of Smad 6 in model group was significantly lower than that in treatment group［（108.2±33.6）vs.（329.4±39.2），P＜0.05］.Conclusions Pirfenidone can inhibit liver fibrosis induced by BSA in rats，which might be attributed to the upregulation of Smad 6.

【Key words】Liver fibrosis；Pirfenidone；Smad6；Rats