朱　翔，路文明，丁寧玲，葉建中，王　鋒，沙　莉，李　揚(yáng)，高勝蘭

截短序列和全序列HBcAg基因以及HBV C-S融合基因的克隆與表達(dá)*

朱翔，路文明，丁寧玲，葉建中，王鋒，沙莉，李揚(yáng)，高勝蘭

【摘要】目的構(gòu)建截短序列和全序列HBcAg基因和HBc-HBsAg融合基因原核表達(dá)質(zhì)粒，研究目的蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及其免疫原性。方法利用HBV全基因（adr亞型）質(zhì)粒pUCmT-HBV分別擴(kuò)增HBsAg截短基因、HBcAg截短基因和HBcAg全基因，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pSK-HBs、pSK-HBc和pKS-HBV C，經(jīng)DNA序列測(cè)定鑒定后，分別將HBcAg截短基因、HBcAg全基因及HBc-HBsAg融合基因亞克隆至表達(dá)質(zhì)粒PET-30a，在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)HBcAg截短基因、HBcAg全基因和HBc-HBsAg融合基因產(chǎn)物，采用PAGE-SDS和免疫印跡法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果成功構(gòu)建了含HBcAg截短基因、HBcAg全基因和HBc-HBsAg融合基因的原核表達(dá)質(zhì)粒；成功構(gòu)建的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中能大量表達(dá)HBcAg蛋白和HBc-HBsAg融合蛋白，免疫印跡分析結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性。結(jié)論成功構(gòu)建的原核表達(dá)載體在大腸桿菌BL21（DE3）中能順利表達(dá)HBcAg蛋白和HBc-HBsAg融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性，為慢性乙型肝炎特異性免疫治療研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；HBsAg；HBcAg；融合蛋白；原核表達(dá)質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)將HBV核心抗原與表面抗原部分基因在原核細(xì)胞中融合表達(dá)，并對(duì)其抗原性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究慢性乙型肝炎特異性免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種與質(zhì)粒大腸桿菌XL1-Blue及質(zhì)粒pBlue-scriptIISK（-）購自Stratagene公司；大腸桿菌菌株BL21（DE3）和表達(dá)載體pET-30a購自EMD Biosciences，Inc.Novagen Brand。含HBsAg全基因和HBcAg全基因（adr亞型）的質(zhì)粒pUCmT-HBV由本實(shí)驗(yàn)室保存。

第一作者：朱翔，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，教授。E-mail：szzhuxiang@hotmail.com

1.2酶及主要試劑分子克隆所用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI、HindIII、EcoRI、NcoI、Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購于 Pharmacia公司；DNA分子標(biāo)準(zhǔn)（DL2，000）、分子蛋白質(zhì)（Broad）標(biāo)準(zhǔn)（Code No：D532S）和 dNTP購 于TaKaRa公司；IPTG、X-gal、玻璃珠（Silver Beads）DNA膠回收試劑盒和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人抗體購于Sangon公司。

1.3PCR引物設(shè)計(jì)與合成參照HBsAg和HBcAg基因（adr亞型）序列，設(shè)計(jì)出6條引物，交由上海Sangon公司合成。分別為擴(kuò)增編碼截短HBsAg基因、截短HBcAg基因和全序列HBcAg基因。擴(kuò)增編碼含截短HBsAg片段（約 150 bp）的PCR上下游引物S1和S2設(shè) 計(jì) 如 下 ，S1：5’-GGGGATCCTGTCTTGCGGCGTTTTATC-3’，此引物被引入了BamHI識(shí)別位點(diǎn)；S2：5’-CCCAAGCTTCTAGGTCTTGCATGGTCCCGT-3’，此引物被引入終止密碼子和 HindIII識(shí)別位點(diǎn)。擴(kuò)增編碼截短的HBcAg片段（約460 bp）的PCR上下游引物C1和C2設(shè)計(jì)如下，C1：5’-GGAATTCCATGGACATTGACCCGTATAAAG-3’，此引物被引入了EcoRI和 NcoI別位點(diǎn)；C1：5’-GGAATTCCATGGACATTGACCGTATAAAG-3’，此引物被引入了EcoRI和NcoI別位點(diǎn)。擴(kuò)增編碼全序列HBcAg基因片段（約560bp）引物設(shè)計(jì)如下，CC1：5’-GGGATCCCATATGGACATTGACCCGTATAAAG-3’，此引物被引入了BamHI和NdeI識(shí)別位點(diǎn)；CC2：5’-CCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAG-3’，此引物被引入了Hind III識(shí)別位點(diǎn)。

1.4目的基因的PCR擴(kuò)增分別用三對(duì)引物從pUCmT-HBV質(zhì)粒上擴(kuò)增出截短HBsAg基因、截短HBcAg基因和全序列HBcAg基因。分別將截短的HBsAg基因、截短的HBcAg基因和全序列HBcAg基因擴(kuò)增片段回收，分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶于37℃進(jìn)行雙酶切4 h，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的條帶，用玻璃珠DNA膠回收試劑盒純化回收DNA，并以相應(yīng)的酶切位點(diǎn)導(dǎo)入pBluescriptIISK（-）載體，回收產(chǎn)物用T4連接酶16℃連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue，涂布氨芐青霉素和卡那霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜。在雙抗篩選平板生長(zhǎng)的單菌落提取質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增鑒定是否有陽性克隆。將PCR陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)一步經(jīng)雙酶切鑒定。用引物S1、S2從pUCmT-HBV質(zhì)粒上擴(kuò)增HBs片段（約 150 bp），用BamHI和Hind III克隆到pSK質(zhì)粒上，稱為 pSK-HBs。用引物 C1、C2從pUCmT-HBV質(zhì)粒上擴(kuò)增截短的HBc基因編碼蛋白N端150個(gè)氨基酸的基因片段（約460 bp），用EcoRI 和BamHI克隆到pBluescriptIIKS（-）質(zhì)粒上，稱為pKS-HBc。用引物CC1、CC2從pUCmT-HBV質(zhì)粒上擴(kuò)增全序列HBcAg基因片段（約560bp），用BamHI 和HindIII酶切，克隆到pBluescriptIIKS（-）質(zhì)粒上，稱為pKS-HBV C。由英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序分析。

1.5表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將測(cè)序正確的克隆用相應(yīng)的內(nèi)切酶克隆到pET-30a質(zhì)粒上，得到不同的表達(dá)質(zhì)粒。①表達(dá)質(zhì)粒pET-HBs的構(gòu)建：將質(zhì)粒pKS-HBs用BamHI和HindIII克隆到質(zhì)粒pET-30a上的相應(yīng)位點(diǎn)上，稱為pET-HBs；②表達(dá)質(zhì)粒pET-HBc的構(gòu)建：將質(zhì)粒pKS-HBc用NcoI和BamHI酶切，得到的460 bp片段克隆到 pET-30a的相應(yīng)位點(diǎn)上，稱為pET-HBc；③表達(dá)質(zhì)粒pET-HBV C的構(gòu)建：質(zhì)粒pKS-HBV C用NdeI和HindIII酶切，酶切得到約560 bp的DNA片段克隆到 pET-30a質(zhì)粒上，得到的表達(dá)質(zhì)粒能夠表達(dá)不帶組氨酰殘基的天然HBV C基因蛋白；④融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET-HBc-HBs的構(gòu)建：質(zhì)粒pKS-HBs用BamHI和HindIII酶切，得到的150 bp片段克隆到pET-HBc的相應(yīng)位點(diǎn)上，最終得到含HBc和HBs的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，稱為pET-HBc-HBs。

1.6表達(dá)質(zhì)粒 pET-HBs、pET-HBc、pET-HBV C和pET-HBc-HBs在大腸桿菌中的表達(dá)

1.6.1表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將表達(dá)質(zhì)粒 pET-HBs、pET-HBc、pET-HBV C和pET-HBc-HBs轉(zhuǎn)化，用氯化鈣處理法得到的感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）菌株，將菌株涂于LB平板上，置37℃培養(yǎng)箱。

1.6.2在大腸桿菌中的表達(dá)在37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為0.6～0.8，加IPTG至終濃度為1mM，再培養(yǎng)5h后離心，收集菌體，加入上樣緩沖液（4%SDS，2%β-巰基乙醇，4%甘油，0.1%溴芬藍(lán)，50 mMTris-HCL，pH 6.8）100℃處理5 min，離心，去除細(xì)菌碎片，保存上清液。

1.6.3表達(dá)蛋白的檢測(cè)誘導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)上述處理后，取20μl上清，進(jìn)行SDS-PAGE分析（分離膠濃度為12%）。按分子克隆所述方法，通過電轉(zhuǎn)移將凝膠中的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，以HBsAb和HBcAb陽性血清（來自我院1例CHB患者）作為一抗，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人抗體為二抗（工作濃度為1∶1000），DAB（0.6g/L）顯色，進(jìn)行Western blot免疫印跡分析，判斷表達(dá)蛋白的免疫原性。

2　結(jié)果

2.1截短HBsAg基因、截短HBcAg基因和HBcAg全基因序列的PCR擴(kuò)增和表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功應(yīng)用我們?cè)O(shè)計(jì)的三對(duì)引物分別從質(zhì)粒pUCmT-HBV上擴(kuò)增出截短HBsAg基因、截短HBcAg基因和HBcAg全部基因片段，得到長(zhǎng)度分別為150 bp、460 bp和560 bp的DNA片段。將純化后的PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒pBluescriptIISK（-）上，構(gòu)成pSK-HBs、pSK-HBc和pSK-HBV C重組質(zhì)粒。隨后將該重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定（圖1），把該質(zhì)粒送到聯(lián)合基因公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與我們?cè)O(shè)計(jì)引物區(qū)間內(nèi)的HBV基因（adr亞型）完全一致。在測(cè)序正確后，用相應(yīng)的內(nèi)切酶從pSKHBs、pSK-HBc和pSK-HBV C質(zhì)粒上將目的DNA片段切出，連接到pET-30a質(zhì)粒上，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pET-HBs、pET-HBc、pET-HBV C和pET-HBc-HBs，以PCR進(jìn)行鑒定（圖2）。

圖1　重組質(zhì)粒pSK-HBV C、pSK-HBc和pSK-HBs的PCR鑒定結(jié)果

M：DNA Marker DL2，000；1：從質(zhì)粒pSK-HBV C擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物；2：從質(zhì)粒pSK-HBc擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物；3：從質(zhì)粒pSK-HBs擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物

圖2　表達(dá)質(zhì)粒pET-HBs、pET-HBc、pET-HBV C和pETHBc-HBs PCR鑒定結(jié)果

M：DNA Marker DL2，000；1：以引物 S1和 S2從質(zhì)粒pET-HBs擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物；2：以引物 C1和C2從質(zhì)粒pET-HBc擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物；3：以引物CC1和CC2從質(zhì)粒pET-HBV C擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物；4：以引物C1和S2從質(zhì)粒pET-HBc-HBs擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物

2.2融合蛋白表達(dá)成功按分子克隆所述方法，檢測(cè)截短HBsAg、截短 HBcAg、HBcAg全基因蛋白和HBc-HBsAg融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達(dá)，在SDS-PAGE凝膠電泳圖（圖3、圖4）上出現(xiàn)不同的表達(dá)情況，截短HBsAg基因在大腸桿菌BL21（DE3）中未見表達(dá)，截短HBcAg基因在大腸桿菌BL21（DE3）中大量表達(dá)，與推測(cè)的蛋白分子量和DNA片段長(zhǎng)度結(jié)果基本一致（編碼 HBcAg的前150個(gè)氨基酸，約為27 kDa，約460 bp），其表達(dá)蛋白約占大腸桿菌總蛋白的50%；HBV C全基因在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)量明顯減少，與推測(cè)的蛋白分子量和DNA片段長(zhǎng)度結(jié)果基本一致（編碼約HBcAg180個(gè)氨基酸，560 bp）；HBc-HBsAg融合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中也有一定量的表達(dá)，與推測(cè)的蛋白分子量和DNA片段長(zhǎng)度結(jié)果基本一致（約610 bp，約為 34 kDa），其融合蛋白約占大腸桿菌總蛋白的10%以下。

圖3　截短的HBsAg、截短的HBcAg和HBV C全基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的PAGE-SDS電泳分析

M：蛋白分子 Marker；1：pET-30a未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)；2：pET-30a經(jīng) IPTG誘導(dǎo)；3：pET-HBs未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)；4：pET-HBs經(jīng) IPTG誘導(dǎo)；5：pET-HBc未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)；6：pET-HBc經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；7：pET-HBV C未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；8：pET-HBV C經(jīng)IPTG誘導(dǎo)

圖4　截短的HBsAg、截短的HBcAg和HBc-HBsAg融合基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的PAGE-SDS電泳分析

M：蛋白分子 Marker；1：pET-30a未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)；2：pET-30a經(jīng) IPTG誘導(dǎo)；3：pET-HBs未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)：4：pET-HBs經(jīng) IPTG誘導(dǎo)；5：pET-HBc未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)；6：pET-HBc經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；7：HBc-HBsAg經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；8：HBc-HBsAg未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)

2.3表達(dá)蛋白的鑒定含重組質(zhì)粒菌在27 kDa和31kDa處出現(xiàn)陽性反應(yīng)帶，而含空表達(dá)質(zhì)粒菌體在該處無蛋白帶，結(jié)果表明表達(dá)蛋白可以被乙型肝炎病毒HBsAb和HBcAb陽性血清所識(shí)別（圖5），表達(dá)的蛋白具有抗原活性，經(jīng)純化后可用于慢性乙型肝炎特異性免疫治療的基礎(chǔ)研究。

圖5　 pET-30a、pET-HBc和HBc-HBsAg基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定經(jīng)Western blot免疫印跡分析，應(yīng)用HBsAb/HBcAb雙陽性血清作為一抗，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗，結(jié)果檢測(cè)出陽性蛋白

M：蛋白分子Marker；1：pET-30a經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2：HBc-HBsAg經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；3：pET-HBc經(jīng)IPTG誘導(dǎo)

3　討論

根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果，HBV S基因核苷酸只有在酵母菌及真核表達(dá)系統(tǒng)才能表達(dá)出具有強(qiáng)抗原決定簇的蛋白，其操作繁瑣、成本高［1～5］。Hee比較了HBsAg全序列中分別由9～10個(gè)氨基酸組成的各種多肽，對(duì)從慢性乙型肝炎患者分離出的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）負(fù)載后誘導(dǎo)特異性CLT的結(jié)果，其中核酸序列第269～278位所編碼抗原多肽LVLLDYQGML介導(dǎo)的HBV特異性CLT反應(yīng)最強(qiáng)，可替代HBsAg負(fù)載介導(dǎo)特異性CLT，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，降低了成本［6～9］。

HBV C基因在不同亞型間均最為保守，在它編碼的180多個(gè)氨基酸中CTL表位多位于第150位氨基酸以前，其中18～27位AA為HLA-A0201所限制，第88～96位AA被HLA-A11所限制，第88～96 位AA為HLA-A11所限制，第141～150位AA為HLA-Aw68和HLA-A31所限制，第75～81位AA或72～88位AA是很強(qiáng)的構(gòu)像型B細(xì)胞表位。因此，核心抗原是比較理想的疫苗研究靶分子。

免疫學(xué)研究證實(shí)，HBcAg可以直接激活B細(xì)胞。因此，它既是一種T細(xì)胞依賴性抗原，又是一種T細(xì)胞非依賴性抗原。同時(shí)由于它的C末端可以結(jié)合少量的核酸，可以使免疫反應(yīng)向Thl方向極化。乙型肝炎病毒各個(gè)基因片段原核表達(dá)難易程度不同，考慮到HBV C基因在不同亞型間最為保守，而HBV C全基因原核表達(dá)量低。本研究選擇截短的HBV C基因前面的450 bp進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-HBc，獲得了高效表達(dá)的目的蛋白，并進(jìn)一步證實(shí)該濃縮蛋白可以與抗HBV陽性血清結(jié)合，說明其具有很好的抗原性和特異性。HBc-HBsAg融合表達(dá)質(zhì)粒pET-HBc-HBs含HBcAg前段1～150氨基酸和含編碼LVLLDYQGML多肽的HBsAg部分基因片段的復(fù)合抗原，使之能夠在大腸桿菌中得到表達(dá)，并具有HBcAg和HBsAg的抗原性和特異性，復(fù)合抗原攜帶更多的病毒抗原表位，更接近HBV病毒顆粒，遺憾的是其表達(dá)量不如單純截短的HBcAg高，但原核表達(dá)成本低，蛋白純化操作方便，與真核表達(dá)相比，獲取目的蛋白十分方便，作為復(fù)合抗原負(fù)載DC介導(dǎo)特異性CTL，可用于針對(duì)慢性乙型肝炎的特異性免疫治療研究。

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（收稿：2014-08-05）

（本文編輯：陳從新）

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.006

*基金項(xiàng)目：蘇州市科學(xué)技術(shù)局科技支撐計(jì)劃（社會(huì)發(fā)展）項(xiàng)目（編號(hào)：YJS0943）

作者單位：210007江蘇省蘇州市蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院（蘇州巿第五人民醫(yī)院）

Cloning and expression of truncated HBcAg gene，whole-length HBcAg gene and HBc-HBsAg fusion gene in vitroZhu Xiang，Lu Wenming，Ding Ningling，et al.Affiliated Infectious Disease Hospital，Soochow University，Suzhou 210007，Jiangsu Province，China

【Abstract】Objective To construct the prokaryotic recombinant plasmidscarring truncated HBcAg gene，whole-length HBcAg gene and HBc-HBsAg fusion gene，and to observe the expression of target proteins in E.coli and their immunogenicity in vitro.Methods Truncated HBcAg gene，whole-length HBcAg gene and HBc-HBsAg fusion gene were obtained from plasmid pUCmT-HBV containing whole-length HBV gene（subtype adr）and construct recombinant plasmids of pSK-HBs，pSK-HBc and pKS-HBV C.Truncated HBcAg gene，whole-length HBcAg gene and HBc-HBsAg fusion gene which were obtained by fusing truncated HBsAg and truncated HBcAg gene，were subcloned into a expression vector pET-30a respectively after confirmed by DNA sequencing.The gene products were expressed in E.coli BL21（DE3）and identified by SDS-PAGE and Western blot.ResultsThe prokaryotic expression plasmids expressing truncated HBcAg gene，whole-length HBcAg gene and HBc-HBsAg fusion gene were successfully constructed.High levels of HBcAg protein and HBc-HBsAg fusion protein were observed in E.coli BL21（DE3）and their immunogenicity were confirmed by Western blot.Conclusion HBcAg protein and HBc-HBsAg fusion protein are successfully obtained by selected expressing vector in E.coli BL21 （DE3）and the gene products have immunogenicity.This study has provided an experimental basis for specific immunotherapy for chronic hepatitis B.

【Key words】Hepatitis B virus；Hepatitis B surface antigen；Hepatitis B core antigen；Fusion protein；Prokaryotic expression plasmid