劉小芹，羅育，曾麒燕（廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧　530021）

白桂木凝集素基因的5’RACE與3’RACE擴增及序列分析

劉小芹，羅育，曾麒燕
（廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，廣西 南寧530021）

摘要：［目的］對白桂木凝集素基因進行擴增及序列分析。［方法］采用RT-PCR結合RACE技術，擴增得到白桂木凝集素（AHL）基因的保守區(qū)域、5’末端及3’末端。用Vector NTI軟件將測序得到的AHL cDNA的保守區(qū)域、5’末端、3’末端進行校正、拼接得到完整AHL cDNA序列。［結果］全長含有933個核苷酸。其推導的氨基酸序列NCBI做BLAST比對，相似度高達70%～80%。［結論］對白桂木凝集素基因的cDNA序列進行研究，可為進一步從分子水平探明白桂木凝集素的作用機制提供科學依據(jù)。

關鍵詞：白桂木凝集素；RACE技術；基因克隆；序列分析

白桂木（Artocarpus hypargyreus Hance）系?？撇_蜜屬常綠喬木，是一種經濟價值很高的樹種，主要分布于桂東南地區(qū)。其根可入藥，味甘、淡，性溫，具有祛風利濕、活血通絡等功效［1］，在民間應用較廣泛。白桂木種子富含白桂木凝集素（Artocarpus hypargyreus Hance lectin，AHL），其藥用價值已經引起醫(yī)藥學界的注意。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AHL能夠促進小鼠骨髓來源樹突狀細胞（BmDC）的分化成熟，能夠抑制人急性白血病T淋巴細胞（Jurkat T）及小鼠T淋巴瘤細胞（EL-4）的增殖［2］；并對白桂木基因組DNA的提取方法進行了研究［3］。本實驗首次報道AHL基因的cDNA序列，為今后進一步從分子水平探明AHL的作用機制及其在臨床疾病防治等方面的開發(fā)應用奠定良好的理論基礎。

1　實驗方法

1.1材料新鮮的白桂木葉子于2013年7月采自廣西藥用植物園，選取其中嫩、大、薄的葉片經液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。Easypure Plant RNA Kit（北京全式金），RT-PCR反轉錄試劑盒（Fermentas），Taq DNA聚合酶，聚乙烯吡 咯 烷 酮 （Polyvinylpyrrolidone，PVP），pMD-18T載 體（Takara），SMARTTMRACE cDNA Amplification kit（BD Bioscience Clontech Company），DNA回收試劑盒（北京全式金），引物合成和測序分別由深圳華大基因科技有限公司和上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2白桂木葉片總RNA抽提參考北京全式金公司的Easypure Plant RNA Kit試劑盒說明書提取總RNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.3AHL基因cDNA保守區(qū)域的獲得根據(jù)NCBI網站上已公布的木菠蘿凝集素家族的mRNA序列，利用Primer 5.0設計擴增AHL基因cDNA保守區(qū)域的特異性引物，見表1。以白桂木總RNA為模板，按照RT-PCR反轉錄試劑盒（Fermentas）的說明方法反轉錄獲得白桂木cDNA。以獲得的白桂木總cDNA為模板，以WBF、WBR為上、下游引物，擴增AHL保守區(qū)域cDNA片段。PCR反應程序為:94℃5 min；94℃30 s；42℃30 s；72℃1 min，共進行35個循環(huán)；72℃10 min。膠回收試劑盒純化回收，將純化后的白桂木PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

表1　 用于擴增AHL基因cDNA保守區(qū)域的引物

1.4AHL基因的5’RACE以AHL基因的cDNA保守區(qū)域的序列為模板，用Primer 5.0設計了兩條特異性引物W51、W52，見表2。按照SMARTTMRACE cDNA Amplification kit說明書操作，合成5’-ready cDNA，以5’-ready cDNA為模板，以W51和UPM（試劑盒中提供）為引物，進行第一輪PCR擴增。PCR反應程序為:94℃5 min；94℃30 s；68℃30 s；72℃3 min，共進行25個循環(huán)；72℃10 min。將PCR產物用TE緩沖液（試劑盒中提供）稀釋50倍作為巢式PCR的模板，以W52和NUP（試劑盒中提供）為引物，進行巢式PCR擴增。巢式PCR反應程序為:94℃5 min；94℃30 s；68℃30 s；72℃3 min，共進行20個循環(huán)；72℃10 min。反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2　AHL 5’RACE引物

1.5AHL基因的3’RACE以AHLcDNA保守區(qū)域的序列為模板，用Primer 5.0設計3’RACE的引物W31、W32，見表3。按照SMARTTMRACE cDNA Amplification kit說明書操作，合成3’-ready cDNA，以3’-ready cDNA為模板，以W31和UPM（試劑盒中提供）為引物進行第一輪PCR擴增。PCR反應程序為:94℃5 min；94℃30 s；68℃30 s；72℃3 min，共進行25個循環(huán)；72℃10 min。將PCR產物用TE緩沖液（試劑盒中提供）稀釋50倍作為巢式PCR的模板，以W32和NUP（試劑盒中提供）為引物進行巢式PCR擴增。巢式PCR的反應程序為:94℃5 min；94℃30 s；68℃30 s；72℃3 min，共進行20個循環(huán)；72℃10 min。反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表3　AHL 3’RACE引物

1.6目的片段測序及序列分析5’RACE、3’RACE擴增條帶切膠回收，連接于pMD-18T載體上，小量抽提質粒DNA，委托上海生工生物工程技術服務有限公司測序。采用Vector NTI對AHL基因的cDNA的保守區(qū)域、5’末端、3’末端進行校正、拼接得到完整AHL cDNA序列。將其推導的AHL氨基酸序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫做BLAST比對。

2　結果與分析

2.1白桂木總RNA提取與檢測利用試劑盒法抽提的白桂木葉片總RNA，經紫外分光光度計檢測，A260/A280比值為1.82，表明所提取的RNA純度很高。瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，抽提的白桂木葉片總RNA沒有受到基因組DNA和蛋白質的污染，28 s核糖體RNA和18 s核糖體RNA的帶型清晰，沒有拖尾現(xiàn)象，兩條帶的亮度比基本呈現(xiàn)2∶1的關系，說明RNA完整性比較好。如圖1。

圖1　白桂木葉片總RNA提取凝膠電泳圖

2.2AHL基因的cDNA保守區(qū)域擴增AHL cDNA保守區(qū)域擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見一條500 bp左右的條帶，如圖2。經測序得保守區(qū)域含有478個核苷酸。

圖2　AHL 基因cDNA 保守區(qū)域瓊脂糖凝膠電泳

2.3AHL RACE擴增和序列分析AHL 5’RACE-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見一條500 bp左右的條帶，測序結果為403個核苷酸，3’RACE-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見一條700bp左右的條帶，測序結果為631個核苷酸。電泳結果如圖3。經Vector NTI校正、拼接得到ALL cDNA全長為952個核苷酸，如圖4。將推導的AHL氨基酸序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫做BLAST比對，發(fā)現(xiàn)AHL與同為桑科的木菠蘿凝集素Jacalin的四種同工凝集素（登陸號為: AAA32677.1，AAA32678.1，AAA32679.1，AAA32680.1）及黑桑凝集素MornigaG的兩種同工凝集素（登陸號為:AAL09163.1，AAM90088.1）相似度最高。相似度為70%～80%。如圖5。

圖3　RACE-PCR產物的電泳結果

圖4　AHL的mRNA序列及推導的氨基酸序列

圖5　AHL與木菠蘿凝集素家族多序列對比

3　討論

伴隨著生物科學技術的迅猛發(fā)展，近年來產生了一系列克隆新基因的方法與技術:圖譜克隆技術，轉座子標簽技術，mRNA差異顯示技術，基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等［1］。SMARTTM3’RACE的原理為:以連接有SMART寡核苷酸序列的通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物，與mRNA3’末端的poly（A）尾結合，逆轉錄合成第一鏈cDNA。再以基因特異性引物GSP1作為上游引物，用含有部分接頭序列的通用引物UPM作為下游引物，以獲得的第一鏈cDNA為模板，進行PCR擴增，從而獲得目的基因的3’末端cDNA序列。SMARTTM5’RACE的原理為:以Oligo（dT）30MN作為鎖定引物在逆轉錄酶MMLV的作用下，與mRNA3’末端的poly（A）尾結合，逆轉錄合成cDNA第一鏈。此逆轉錄酶具有末端轉移酶的活性，當逆轉錄到達cDNA第一鏈的5’末端時，會在其末端自動加上3～5個dC殘基，退火后，dC和含有Oligo（dG）的SMART寡核苷酸序列的通用接頭引物配對，轉換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭。以SMART cDNA第一鏈作為模板，以含有部分接頭序列的通用引物UPM和基因特異性引物GSP2為上、下游引物，進行PCR擴增，擴增目的基因5’末端序列。

根據(jù)邢桂春等［4］的研究發(fā)現(xiàn)，使用CLONTECH的SMARTTMRACE技術能夠獲得更長的片段。SMART RACE采用了自動熱啟動的技術，通過在Advantage 2 Ploymerase中加入其單克隆抗體，使得在溫度上升到抗體失活之前，抗體可以阻礙聚合酶的活性，使實驗取得了較好的結果［5］。特異性引物的設計是RACE反應能否成功的關鍵因素［6］。本實驗通過設計26～28個堿基，GC含量大于50%，Tm值大于70℃的引物來提高反應的特異性。本實驗進行首輪RACE-PCR擴增后，產物上樣于1%瓊脂糖凝膠，電泳檢驗無擴增條帶，分析其原因可能因為模板濃度過低，退火溫度過低，PCR循環(huán)次數(shù)過多等。針對上述可能原因，本實驗通過同等條件下設置不同量的模板，進行梯度PCR摸索退火溫度，減少循環(huán)次數(shù)等，均未獲得特異性條帶。徐燁等［6］研究發(fā)現(xiàn)，把巢式PCR和RACE技術相結合能夠提高克隆的精準度。本實驗將第一輪PCR擴增的產物稀釋50倍后作為模板，以NUP和NGSP為引物，進行巢式PCR擴增，經電泳檢測獲得了理想的條帶。巢式PCR（nested PCR）是由普通PCR技術衍生出的一種新的PCR技術，在分子生物學理論研究與醫(yī)學檢測方面的研究應用比較多［7-10］。其原理為設計外、內兩對特異性PCR引物，進行兩輪PCR擴增。使用外側引物進行首輪PCR。以得到的擴增產物為模板，使用內側引物進行第二輪PCR來擴增所需目的片段［11］。另外需要指出的是，使用RACE技術獲得新基因的末端片段時，需要盡可能多地選擇陽性重組體進行測序，獲得新基因全長序列的幾率會更高。

參考文獻

［1］張秀實，吳征鎰.中國植物志:第23卷［M］.北京:科學出版社，1998:49.

［2］李璐.桂木凝集素對BmDC分化成熟及對EL-4、Jurkat T細胞增殖的影響［D］.南寧:廣西醫(yī)科大學，2013.

［3］劉小芹，羅育，曾麒燕.兩種提取白桂木基因組DNA方法的比較研究［J］.廣西中醫(yī)藥大學學報，2014，17（2）:71-72.

［4］邢桂春，張成崗，魏漢東，等.采用RACE技術獲得全長人新基因MAGE-D1［J］.中國生物化學與分子生物學報，2001，17（2）:203-208.

［5］沈元月.RACE技術研究進展與展望［J］.生物技術通報，2008（增刊）:132-135.

［6］徐燁，劉雅婷，代文瓊，等.幾種主要的RACE技術及應用［J］.中國農業(yè)科技導報，2012，14（2）:81-87.

［7］Ledwidge S A，Mallard B A，Gibson J P，et al.Multi-primer target PCR for rapid identification of bovine DRB3 alleles ［J］.Animal genetics，2001，32（4）:219-221.

［8］Navaneetham D，Penn A S，Howard Jr J F，et al.TCR-Vβ usage in the thymus and blood of myasthenia gravis patients ［J］.Journal of autoimmunity，1998，11（6）:621-633.

［9］Atzori C，Agostoni F，Angeli E，et al.Combined use of blood and oropharyngeal samples for noninvasive diagnosis of Pneumocystiscarinii pneumonia using the polymerase chain reaction［J］.European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases，1998，17（4）:241-246.

［10］Yang J，Luo K，Guo Y，et al.Classification of genotyping hepatitis B virus with multiplex PCR［J］.Zhonghuaganzangbingzazhi，2002，10（1）:55-57.

［11］Porter-Jordan K，Rosenberg E I，Keiser J F，et al.Nested polymerase chain reaction assay for the detection of cytomegalovirus overcomes false positives caused by contaminationwithfragmentedDNA［J］.Journalofmedicalvirology，1990，30（2）：85-91.

（編輯陳明偉）

中圖分類號：Q78

文獻標識碼：A

文章編號：2095-4441（2015）02-0067-05

收稿日期:2015-03-27

基金項目:國家自然科學基金（編號:81160366）；廣西自然科學基金（編號:2011jjA40535）通信作者:曾麒燕，E-mail:2257994291@qq.com