丁健科, 蘇映軍, 張棟梁, 陳 晨, 陳建武, 余 州, 宋雅娟, 莊 然, 郭樹忠

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實(shí)驗(yàn)研究

化學(xué)修飾的凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠異體皮膚移植耐受的研究

丁健科, 蘇映軍, 張棟梁, 陳 晨, 陳建武, 余 州, 宋雅娟, 莊 然, 郭樹忠

資金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30830102) 作者單位：710032 陜西 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所(丁健科,蘇映軍, 張棟梁,陳 晨,陳建武,余 州, 宋雅娟,郭樹忠)；第四軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)部免疫教研室(莊 然) 第一作者：丁健科(1990-)，男，四川人，碩士研究生. 通信作者：郭樹忠,710032,第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所，電子信箱：shuzhong@fmmu.edu.cn

目的 研究ECDI處理的脾細(xì)胞對(duì)同種異體皮片存活的影響，并初步探討其機(jī)制。方法 建立小鼠尾部全厚皮片移植模型，隨機(jī)法分5組。control組：免疫排斥組；rapa組：?jiǎn)为?dú)使用3 mg/kg雷帕霉素組；ECDI-SPs twice組：移植前7 d及移植后1 d輸注108ECDI-SPs聯(lián)合雷帕霉素組；SPs組：移植前7 d及移植后1 d輸注未經(jīng)處理脾細(xì)胞聯(lián)合雷帕霉素組；ECDI-SPs x3組：移植前7 d、移植后1 d及7 d 3次輸注ECDI-SPs聯(lián)合雷帕霉素組。結(jié)果 ECDI處理的脾細(xì)胞迅速發(fā)生了凋亡，ECDI-SPs兩次輸注明顯延長(zhǎng)了同種異體小鼠皮片存活時(shí)間(P<0.05)，ECDI-SPs 3次輸注皮片存活同2次輸注差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ECDI-SP輸注后小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例增加(P<0.05)。結(jié)論 ECDI-SPs聯(lián)合雷帕霉素能延長(zhǎng)同種異體小鼠皮片存活時(shí)間，可能機(jī)制與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞升高有關(guān)。

乙基碳二亞胺; 凋亡； 皮片移植； 復(fù)合組織移植； 免疫耐受； 雷帕霉素

異體復(fù)合組織移植在過去十年間已成功地在臨床開展。截止目前，全球至少進(jìn)行了28例臉移植，124例手移植[1]，這一方法已經(jīng)成為臨床修復(fù)嚴(yán)重創(chuàng)傷的一種有效手段。然而，免疫抑制劑所帶來(lái)的不良反應(yīng)給患者帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，像實(shí)體器官移植一樣，構(gòu)建安全、有效的誘導(dǎo)供體特異耐受的方法是解決這一問題的有效手段[2-6]。 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可通過物理和化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)[7-11]，這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，ECDI在建立抗原特異性免疫耐受方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。盡管目前異體復(fù)合組織移植與實(shí)體器官移植所使用的免疫抑制劑方案類似，復(fù)合組織移植后發(fā)生急性排斥的概率更高[12]。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，異體復(fù)合組織移植物在肌肉血管等組織完好的情況下，皮膚組織仍然發(fā)生了排斥[13]。因此，尋找誘導(dǎo)皮膚移植耐受的方案，是誘導(dǎo)復(fù)合組織移植耐受的首要任務(wù)。自2014年10月至2015年7月，我們研究探討了ECDI-SPs細(xì)胞療法對(duì)于免疫原性較強(qiáng)皮片移植的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

近交系雌性Balb/c小鼠，雌性C57bl/6小鼠，6～10周齡，均來(lái)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境。ECDI(美國(guó)SIGMA公司)；紅細(xì)胞裂解液、Annexin-V-PI凋亡檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞儀C6(美國(guó)BD公司)；戊巴比妥(佛山市實(shí)驗(yàn)化工廠)；小鼠Treg測(cè)定試劑盒、Foxp3抗體、CD25抗體、CD4抗體(美國(guó)EBIOSCIENCE公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠全厚皮片移植模型及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 供體皮膚來(lái)自Balb/c小鼠尾部全厚皮1 cm×1 cm，受區(qū)為C57小鼠左側(cè)胸壁全層皮膚去除后創(chuàng)面。植皮后術(shù)區(qū)包扎固定，定期觀察皮片排斥情況，部分小鼠植皮區(qū)定期取材，標(biāo)本經(jīng)固定、包埋、切片、染色后，行鏡下組織病理學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組(圖2a)：control組:受體小鼠僅接受皮片移植；rapa組：小鼠接受皮片移植后，于植皮術(shù)前1 d，開始每日給予3 mg/kg雷帕霉素至術(shù)后28 d，或至移植皮片完全排斥時(shí)；ECDI-SPs 2組：植皮術(shù)前7 d及植皮后1 d，分別給予受體小鼠輸注ECDI-SPs，并于植皮術(shù)前1 d至術(shù)后28 d，給予小鼠3 mg/kg雷帕霉素；SPs組：植皮前7 d及植皮后1 d，分別輸注未處理SPs并給予雷帕霉素，劑量及給藥時(shí)間同上；ECDI-SPs x3組：于植皮前7 d、植皮后1 d及7 d，分別3次輸注ECDI-SPs并給予雷帕霉素，劑量及給藥時(shí)間同上。

1.2.2 ECDI處理SPs及輸注方法 在無(wú)菌條件下，獲取Balb/c小鼠脾臟并制備單個(gè)脾細(xì)胞(splenocyte, SPs)懸液，以紅細(xì)胞裂解液(BD)去除紅細(xì)胞后，以臺(tái)酚藍(lán)染色示細(xì)胞活性大于90%，再以PBS反復(fù)洗2次，重懸細(xì)胞至3.2×108/ml，加入0.171 ml新鮮配置的濃度為150 mg/ml的ECDI。冰上孵育1 h， PBS洗2次，重懸細(xì)胞至5×108/ml，經(jīng)球后靜脈叢給予小鼠200 μl細(xì)胞懸液，對(duì)照組小鼠輸注未經(jīng)ECDI處理的相同體積與細(xì)胞數(shù)量的SPs懸液。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 采用細(xì)胞凋亡試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，將ECDI處理以及未經(jīng)處理的小鼠SPs以PBS洗2次后，一部分細(xì)胞以Binding buffer重懸至2×106/ml，然后將這些細(xì)胞與FITC結(jié)合的Annexin-V(美國(guó)BD公司)以及PI常溫下孵育15 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀C6(美國(guó)BD公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡壞死情況；其余SPs用完全培養(yǎng)基重懸至2×106/ml，利用6孔板培養(yǎng)于37°、5% CO2孵箱，固定時(shí)間點(diǎn)再次染色上機(jī)。各組部分實(shí)驗(yàn)小鼠在移植后10 d，頸椎脫臼處死，取小鼠脾臟，制備小鼠單個(gè)SPs懸液；經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理后去除紅細(xì)胞，獲得SPs細(xì)胞懸液，利用FITC結(jié)合的CD4抗體、APC結(jié)合的CD25抗體進(jìn)行細(xì)胞膜表面染色，破膜后，用PE結(jié)合的Foxp3抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色，上機(jī)檢測(cè)Treg占CD4+T細(xì)胞比例。

1.2.4 病理學(xué)觀察 當(dāng)移植皮膚出現(xiàn)肉眼可見的紅斑時(shí)，即判斷為排斥反應(yīng)開始發(fā)生。當(dāng)紅斑區(qū)域較大，進(jìn)而發(fā)展為皮片組織壞死、結(jié)痂、脫落、出現(xiàn)創(chuàng)面，至受累面積達(dá)到整個(gè)移植皮片80%時(shí)，設(shè)為排斥終點(diǎn)。

植皮術(shù)后10 d，分別取各組小鼠移植皮片標(biāo)本，經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片后，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，鏡下觀察皮膚組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，參考Banff 2007評(píng)價(jià)排斥反應(yīng)程度[14]。

2 結(jié)果

2.1 ECDI處理對(duì)SPs的影響

通過FITC結(jié)合的Annexin-V染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，我們檢測(cè)了小鼠SPs在經(jīng)ECDI處理1 h后的細(xì)胞凋亡狀態(tài)。如圖1所示，正常SPs凋亡染色比例占18%(圖1a)，經(jīng)ECDI處理1 h后凋亡比例占52%(圖1b)；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，細(xì)胞凋亡比例高達(dá)87%(圖1c)，與ECDI處理前相比(圖1d)，此時(shí)，大部分細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入凋亡晚期(圖1e)。圖1為5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的代表圖。

圖1 ECDI處理誘導(dǎo)SPs凋亡 a～c. 經(jīng)ECDI冰上處理1 h后，凋亡細(xì)胞比例逐漸增加，4 h后高達(dá)87% d,e. 處理4 h后細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡階段

Fig 1 Apoptosis of splenocyte exposured to ECDI. a～c. the proportion of SPs apoptosis increased after exposure to ECDI at 1 h and reached to 87% at 4 h. d,e. the advanced stage of SPs apoptosis at 4 h.

2.2 靜脈輸注ECDI-SPs明顯延長(zhǎng)了皮片存活時(shí)間

為了研究輸注ECDI-SPs對(duì)MHC完全不匹配的小鼠皮膚移植存活的影響，我們?cè)谝浦睬? d以及移植后1 d，靜脈輸注了1×108EDCI-SPs或SPs并聯(lián)合應(yīng)用了28 d的雷帕霉素。結(jié)果顯示，兩次輸注ECDI-SPs使移植皮片中位生存時(shí)間(Median Survival Time, MST=28 d)顯著長(zhǎng)于僅使用雷帕霉素組(MST=14 d，P=0.0084)以及聯(lián)合給予SPs和雷帕霉素組(MST=10，P=0.0019)。control組MST為11 d。靜脈輸注SPs聯(lián)合雷帕霉素的D組小鼠皮片存活時(shí)間，短于單純使用雷帕霉素的B組(MST=14，P=0.0039)，二者差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腹腔注射3 mg/kg雷帕霉素，能在一定程度上延長(zhǎng)皮片排斥時(shí)間(P=0.024)，但是并不能長(zhǎng)期有效地保護(hù)移植物。為了探討ECDI-SPs對(duì)皮片的保護(hù)是否與細(xì)胞注射次數(shù)有關(guān)，我們還設(shè)計(jì)了ECDI-SPs3次輸注組，但是單純?cè)黾虞斪⒋螖?shù)，并沒有明顯延長(zhǎng)移植物的存活(P=0.508)。采用聯(lián)合給予ECDI-SPs和雷帕霉素的方法，使小鼠皮片在移植后30 d，仍有部分存活，而其他組在移植早期均發(fā)生了免疫排斥。

2.3 病理組織學(xué)觀察

經(jīng)ECDI-SPs 2次及3次輸入組移植皮片內(nèi)可見血管周圍及表皮有輕微炎癥浸潤(rùn)而無(wú)表皮的角化不良，據(jù)Banff 2007標(biāo)準(zhǔn)為Grade Ⅱ度排斥；雷帕霉素組可見密集炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)伴有表皮輕微的壞死和角化不良，據(jù)Banff 2007標(biāo)準(zhǔn)為Grade Ⅲ度排斥；SPs組表皮嚴(yán)重角化不良，表皮真皮分離并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，致壞死出現(xiàn),據(jù)Banff 2007標(biāo)準(zhǔn)為Grade IVb度排斥。

2.4 靜脈輸注ECDI-SPs聯(lián)合應(yīng)用雷帕霉素增加了小鼠脾臟CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例

CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在誘導(dǎo)和維持外周耐受中起重要作用，因此，我們?cè)谝浦埠?0 d，獲取各組小鼠脾臟細(xì)胞，檢測(cè)Treg比例。ECDI-SPs 2次輸入組以及3次輸入組中Treg比例[(18±0.7)%,n=3；(21.6±2.8)%,n=3]，均顯著高于僅給予雷帕霉素組[(7.7±1)%，n=3，均P<0.05]和聯(lián)合給予SPs和雷帕霉素組[(11.6±1.6)%,n=3，均P<0.05]，后兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.098)，ECDI-SP 3次輸入組與ECDI-SPs 2次輸入組間，亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.14)。

3 討論

美國(guó)西北大學(xué)Luo研究組采用輸注ECDI-SPs的方法成功誘導(dǎo)了小鼠對(duì)異體胰島細(xì)胞移植后的長(zhǎng)期免疫耐受，這一誘導(dǎo)方案中無(wú)需免疫抑制劑、短暫淋巴細(xì)胞清除或共刺激分子阻斷劑[6]。在高抗原性的皮膚組織移植研究中，Elliott等利用ECDI-SPs雖延長(zhǎng)了MHC半相合小鼠移植皮片的存活時(shí)間[15]，但該方法未能延長(zhǎng)MHC完全不匹配的小鼠移植皮片存活時(shí)間。本研究利用多次輸注ECDI-SPs聯(lián)合雷帕霉素應(yīng)用顯著延長(zhǎng)了MHC完全不匹配的小鼠移植皮片存活時(shí)間，經(jīng)對(duì)比2次輸注和3次輸注ECDI-SPs細(xì)胞對(duì)移植物的影響，結(jié)果顯示僅增加1次細(xì)胞輸注并不能進(jìn)一步延長(zhǎng)皮片存活。

以往研究已證實(shí)，ECDI處理后的細(xì)胞在體外可迅速發(fā)生凋亡，此外， ECDI處理的細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射后3 h內(nèi)，大部分細(xì)胞成為碎片[16]。ECDI-SPs在進(jìn)入體內(nèi)后迅速被脾邊緣區(qū)巨噬細(xì)胞吞噬，并引發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子，如IL-10和TGF-β等。在富含抑制性細(xì)胞因子的微環(huán)境中抗原提呈細(xì)胞低表達(dá)共刺激分子CD80和CD86，導(dǎo)致異體抗原提呈給受體T細(xì)胞時(shí)引起供體特異性的T細(xì)胞無(wú)能[8]。另外一方面，共抑制分子PD-1也被證實(shí)在誘導(dǎo)耐受過程發(fā)揮重要作用，在利用抗體阻斷PD-1或者PD-L1都將阻止耐受現(xiàn)象的產(chǎn)生[6]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞被認(rèn)為是誘導(dǎo)和維持外周耐受重要的細(xì)胞群，而其比例的增高與免疫耐受誘導(dǎo)成功率相關(guān)，并可以維持免疫耐受狀態(tài)而使需免疫抑制劑的用量得以降低。近期的研究表明,移植物耐受取決于早期Tregs歸巢至移植物引流淋巴結(jié)和移植物組織內(nèi)，這樣才能有效地抑制天然T細(xì)胞的激活和效應(yīng)T細(xì)胞的功能[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在輸注ECDI-SPs后，小鼠脾臟的Treg明顯上升，ECDI-SPs 2次及3次組小鼠CD4+Foxp3+Treg明顯高于雷帕組和SPs組。SPs組Treg相比對(duì)照也具有升高趨勢(shì)，這可能是由于供體特異性輸注能增高Treg的比例，但這并不能延長(zhǎng)移植物的存活，這可能是因?yàn)樘崆按髣┝康漠愺w抗原輸注引起了受體致敏，導(dǎo)致更為強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)。

目前，在臨床上成功誘導(dǎo)移植物耐受的方案大多需要比較強(qiáng)的預(yù)處理，這很大程度上限制了耐受誘導(dǎo)方案的推廣。而像復(fù)合組織移植作為一種整形手術(shù)，只有在安全的情況下才能推廣，因此，尋找更加安全和低不良反應(yīng)的耐受誘導(dǎo)方案十分重要。與心臟等實(shí)體器官不同，單純ECDI-SPs聯(lián)合免疫抑制劑并不能誘導(dǎo)皮膚移植耐受，可能與皮膚免疫原性最強(qiáng)有關(guān)，要誘導(dǎo)皮片移植長(zhǎng)期存活還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

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讀者·作者·編者

參考文獻(xiàn)中英文作者名的著錄方法

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Study on chemically modified apoptotic donor cells induced immune tolerance in skin allografts of mice

DINGJian-ke,SUYing-jun,ZHANGDong-liang,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

Objective To investigate the effect of ECDI-SPs on the survival of a full-thickness skin allograft and its mechanism. Methods Full-thickness skin transplantation was established and mice were divided randomly into five groups; Control group: the skin allograft without treatment; Rapa group: skin allograft with 3 mg/kg rapamycin for 28 days; ECDI-SPs twice group: ECDI-treated splenocytes were injected i.v. on day 7 before(-7)and 1 day after (+1) skin transplantation with 3 mg/kg rapamycin for 28 days; SPs group: Untreated splenocytes were injected the same way and time as ECDI-SPs twice group with 3 mg/kg rapamycin for 28 days; ECDI-SPs x3 group: Another time of ECDI-treated splenocytes were injected 7 day after skin transplantation on the basis of ECDI-SPs twice group. Results Infusions of donor splenocytes treated with ECDI prolonged skin allograft survival significantly (P<0.05), and there were no significant difference between ECDI-SPs twice and x3 group (P>0.05), the proportion of regulatory T cells increased in ECDI-SPs twice and x3 group (P<0.05). Conclusion Pre-and post-transplant infusions of splenocytes treated with ECDI prolonged skin allograft survival probably by up-regulation of regulatory T cells in spleen.

Ethylene carbodiimide; Apoptosis; Skin transplantation; Composite tissue allotransplantation; Immune tolerance; Rapamycin

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.12.021

R-322

A

1673-7040(2015)12-0761-04

2015-07-22)