劉和平等

[摘要] 目的 對(duì)荊膚止癢顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行再提高研究。 方法 采用高效薄層色譜法（HPTLC）鑒別處方中君藥荊芥；采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定臣藥野菊花中蒙花苷的含量，色譜條件：Agilent Zobrax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-2%冰醋酸水溶液（21∶79）為流動(dòng)相，柱溫20℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm。 結(jié)果 荊芥的供試品色譜與對(duì)照藥材色譜在相應(yīng)的位置上有相同的粉紅色斑點(diǎn)，陰性樣品溶液無干擾斑點(diǎn)，方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好；蒙花苷HPLC含量測(cè)定方法分離度好、準(zhǔn)確度高，蒙花苷在15.26～762.96 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y = 12.7672X + 17.254 18，r = 0.999 98，定量限度為1.83 ng，平均加樣回收率為101.28%，RSD為0.28%（n = 9）。 結(jié)論 通過對(duì)君藥荊芥和臣藥野菊花的質(zhì)量控制方法的建立和驗(yàn)證，提高了荊膚止癢顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，能更好地監(jiān)控該產(chǎn)品的質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 荊膚止癢顆粒；蒙花苷；荊芥；含量；高效液相色譜；高效薄層色譜法

[中圖分類號(hào)] R28 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）06（c）-0105-05

荊膚止癢顆粒（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z10970119）由荊芥、地膚子、野菊花、防風(fēng)、魚腥草、茯苓、山楂7味中藥及糊精等輔料制成的顆粒劑，用于兒童風(fēng)熱型或濕熱型丘疹性蕁麻疹的治療[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，荊膚止癢顆粒對(duì)丘疹性蕁麻疹濕熱證和風(fēng)熱癥的治療效果均較好，且臨床用藥安全[2-4]。本方以輕揚(yáng)透散、疏風(fēng)止癢、解毒透疹的荊芥和清熱利濕、祛風(fēng)止癢的地膚子共為君藥，以清熱解毒散風(fēng)的野菊花和清熱解毒除濕的魚腥草以及散表祛邪、散風(fēng)止癢的防風(fēng)共為臣藥。故野菊花是本方主藥之一，為菊花科植物野菊花（Chrysanthemum indicum L.）干燥頭狀花序，具有清熱解毒、涼肝明目的功效[5]。野菊花含有蒙花苷、木犀草素、金合歡素、芹菜素、異澤蘭黃素等多種有效化學(xué)成分[6-8]，蒙花苷是野菊花中重要的黃酮類化合物，研究表明野菊花總黃酮及蒙花苷對(duì)葡萄牙假絲酵母具有明顯的抗菌活性等多種作用[9]，是本方的有效成分之一。目前已有報(bào)道對(duì)野菊花藥材及其制劑中的單一或多種成分進(jìn)行定量分析[10-12]，均以高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行測(cè)定。荊芥為方中君藥，文獻(xiàn)報(bào)道[13-16]，荊芥中除含揮發(fā)油，還有橙皮苷、荊芥苷、木犀草素等黃酮類成分。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只建立了地膚子、野菊花、魚腥草薄層色譜鑒別和防風(fēng)中5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測(cè)定，缺乏荊膚止癢顆粒中主要功效成分君藥荊芥的薄層鑒別和對(duì)具有明顯抗菌活性作用的蒙花苷的含量測(cè)定。為了提高藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更全面地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本研究在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了君藥荊芥的薄層色譜鑒別和臣藥野菊花中蒙花苷HPLC含量測(cè)定方法，為荊膚止癢顆粒申報(bào)中藥品種保護(hù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設(shè)備

自動(dòng)點(diǎn)樣儀LINOMAT 5（瑞士CAMAG）；雙槽展開缸；MICROTEK Scan Maker 3830掃描儀；Agilent 1260快速高效液相色譜儀（含G1311B 四元泵、G1329B自動(dòng)控溫自動(dòng)進(jìn)樣器、G4218A DAD檢測(cè)器、Chemstation色譜數(shù)據(jù)處理工作站，美國(guó)安捷倫）；KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CPA225D電子天平（德國(guó)賽多利斯）。

1.2 試劑與試藥

硅膠G高效薄層板，青島海洋化工，批號(hào)20100808；甲醇（Merck色譜純，批號(hào)：1728707408）、乙腈（Merck色譜純，批號(hào)：1730130410），乙酸乙酯（分析純，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20101001-2），甲苯（分析純，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20071204-2），甲酸（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：111119-1），冰醋酸（分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)：20100920）。水為自制超純水，香草醛（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20091201）。荊芥對(duì)照藥材、蒙花苷（Buddleoside）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：111528-201107）；10批荊膚止癢顆粒（批號(hào)：1005002064、1005012107、1102001108、0706006001、0708008027、0705004105、0708007112、0711009048、0705003058、0911012106）由麗珠醫(yī)藥集團(tuán)四川光大制藥有限公司生產(chǎn)和提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 荊芥薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取本品6 g，研細(xì)，加甲醇40 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的乙酸乙酯萃取3次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過微孔濾膜（0.45 μm，確保帶狀點(diǎn)樣的可操作性），取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2 陰性溶液制備 取缺少荊芥藥材的陰性樣品6 g，按照供試品溶液制備方法制備荊芥陰性供試液。

2.1.3 對(duì)照藥材溶液制備 另取荊芥對(duì)照藥材粉末1 g，加甲醇20 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過微孔濾膜（0.45 μm），取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.4 薄層色譜鑒別 照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B），分別吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液及荊芥陰性供試液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G高效薄層板上（條帶狀點(diǎn)樣），以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展開劑，展開8 cm，取出，揮干，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的粉紅色斑點(diǎn)，在與荊芥陰性供試液色譜相應(yīng)的位置上，沒有相同顏色的干擾斑點(diǎn)（圖1）。

2.2 野菊花中蒙花苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent Zobrax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-2%冰醋酸水溶液（21∶79）；柱溫：20℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL，DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm，分離度不低于1.5，理論塔板數(shù)以蒙花苷計(jì)不低于3000。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取蒙花苷對(duì)照品適量，置于有P2O5的真空干燥器中減壓干燥12 h，精密稱定，加甲醇溶解（必要時(shí)加熱）制成每1 mL含15 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試液制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，研成細(xì)粉末過3號(hào)篩，取0.5 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇超聲提?。üβ?00 W，頻率45 Hz）30 min，取出，放至室溫，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，濾液過微孔濾膜（0.45 μm），取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 專屬性考察 取不含野菊花藥材的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備野菊花陰性對(duì)照溶液，吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，分別注入色譜儀中，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間位置上，有一相同的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在此待測(cè)組分處無干擾的色譜峰，結(jié)果表明方法的專屬性良好（圖2）。

2.2.5 提取溶劑的選擇 取同一樣品粉末（批號(hào)：1005002064）0.5 g，平行3份，分別用30%甲醇，70%甲醇和甲醇提取溶劑，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，測(cè)定并記錄色譜圖，結(jié)果色譜圖中蒙花苷峰面積分別為2311.33、2673.48和2015.12，表明70%甲醇的提取率最高，故確定70%甲醇作為提取溶劑。

2.2.6 提取時(shí)間的選擇 取同一樣品粉末（批號(hào)：1005002064）0.5 g，平行3份，分別采用超聲15、30、45 min的方式，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，測(cè)定并記錄色譜圖，結(jié)果色譜圖中蒙花苷峰面積分別為1683.38、1788.92和1798.98，表明超聲30 min，基本可以提取完全，故提取方式選用超聲30 min。

2.2.7 柱溫比較 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：1005002064），分別采用了不同柱溫15、20、25、30、35℃，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定并記錄色譜圖，結(jié)果表明，20℃時(shí)色譜圖的主要色譜峰分離度及響應(yīng)值最佳，故色譜柱溫度選擇20℃。

2.2.8 流速比較 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：1005002064），分別采用了0.8、1.0、1.2 mL/min的流速，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定并記錄色譜圖，結(jié)果表明，流速為1.0 mL/min時(shí)色譜圖的主要色譜峰分離度較佳，故流動(dòng)相的流速選擇1.0 mL/min。

2.2.9 色譜柱比較 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：1005002064），分別采用不同品牌的色譜柱Discovery C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、 Zobrax C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定并記錄色譜圖，結(jié)果表明，Zobrax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱主要色譜峰分離度較佳。再精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：1005002064），分別采用同一型號(hào)Zobrax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）不同批次的色譜柱（批號(hào)：B10207、B11281、B10126），按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定并記錄色譜圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同批次色譜柱的蒙花苷色譜峰面積RSD<2%（n = 6），表明，所選用的同一型號(hào)Zobrax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）不同批次的色譜柱重復(fù)性良好。

2.2.10 流動(dòng)相耐受性 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：1005002064），改變流動(dòng)相比例±5%，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定并記錄色譜圖，試驗(yàn)結(jié)果各色譜圖中蒙花苷的分離度均達(dá)到1.5以上，表明本方法的流動(dòng)相耐受性良好。

2.2.11 線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為15.26 μg/mL的對(duì)照品溶液1、2、4、6、10、15 μL，以及濃度為76.296 μg/mL的對(duì)照品溶液5、10 μL，注入液相色譜儀中，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品絕對(duì)量為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Y=12.7672X+17.254 18，r=0.999 98。結(jié)果表明，蒙花苷在15.26～762.96 ng范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。將濃度為15.26 μg/mL的對(duì)照品溶液稀釋25倍，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣3 μL，測(cè)定，得到的色譜峰峰高約為基線的10倍，對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的量1.83 ng，即定量限度為1.83 ng。

2.2.12 儀器精密度 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：1005002064），按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，蒙花苷色譜峰面積的RSD值為0.24%（n = 6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.13 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：1005002064），按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在第0、1、3、6、12、24、48 h不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定，蒙花苷色譜峰的面積RSD值為0.44%（n = 7），結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.14 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品（批號(hào)：1005002064）粉末，平行6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果蒙花苷平均含量為0.149%，RSD值為0.84%（n = 6），表明本法重復(fù)性良好。

2.2.15 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已知蒙花苷含量的同一樣品（批號(hào)：1005002064）粉末，平行9份，以80%、100%、120%三個(gè)水平分別加樣，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每組蒙花苷加樣平均回收率在95%～105%之間，RSD均<1%（n = 9），結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度良好（表1）。

2.2.16 樣品測(cè)定 取10批荊膚止癢顆粒樣品粉末，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

根據(jù)樣品測(cè)定數(shù)據(jù)，考慮本品生產(chǎn)的實(shí)際情況，暫定本品每袋含野菊花以蒙花苷（C28H32O14）計(jì)算不得少于1.0 mg。

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)的選擇

荊膚止癢顆粒（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z10970119）為麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司的獨(dú)家品種，已上市多年，產(chǎn)生了較大的經(jīng)濟(jì)效益，為了申報(bào)中藥品種保護(hù)，需要在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，開展質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究。荊芥為方中君藥，主要含揮發(fā)油、橙皮苷、荊芥苷、木犀草素等成分。原標(biāo)準(zhǔn)中沒有荊芥的鑒別，曾分別對(duì)荊芥的揮發(fā)性成分和橙皮苷的鑒別進(jìn)行了條件摸索，但均無法排除陰性干擾，故建立了以荊芥對(duì)照藥材為參照的薄層色譜鑒別方法。野菊花為方中的臣藥，處方用藥量大，所含的蒙花苷為本品主要抗菌類成分之一，《中國(guó)藥典》2010年版一部野菊花含量測(cè)定是以蒙花苷為含測(cè)指標(biāo)，所以本實(shí)驗(yàn)建立了蒙花苷含量測(cè)定方法。新建立的荊芥薄層鑒別和蒙花苷含量測(cè)定方法，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠、重復(fù)性好，使原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)得到提高，為荊膚止癢顆粒申報(bào)中藥品種保護(hù)提供技術(shù)支持。

3.2 薄層鑒別項(xiàng)

在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)曾摸索了展開劑乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）、甲苯-吡啶-甲酸（36∶9∶5）、甲苯-甲醇-乙酸（35∶5∶5）、甲苯-三氯甲烷-丙酮（40∶25∶35）、甲苯-甲醇-丁酮（60∶20∶20）、甲苯-吡啶-甲酸（36∶9∶5）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1），結(jié)果黃酮類成分薄層色譜經(jīng)典展開劑甲苯-乙酸乙酯-甲酸系統(tǒng)的分離效果最好。比較了不同的顯色劑5%的三氯化鋁乙醇溶液、10%的硫酸乙醇溶液、5%的香草醛濃硫酸溶液，結(jié)果目標(biāo)成分在香草醛濃硫酸溶液下顯粉紅色斑點(diǎn)，故選擇5%的香草醛濃硫酸溶液作為顯色劑。比較了不同生產(chǎn)廠家的高效薄層板和普通薄層板，結(jié)果德國(guó)Merck公司生產(chǎn)的普通硅膠G薄層板和高效硅膠G薄層板的分離度均符合要求，青島海洋化工廠生產(chǎn)的高效硅膠G薄層板的分離度符合要求，但其普通硅膠G薄層板的分離度達(dá)不到要求，不能使用。薄層色譜鑒別采用瑞士CAMAG公司的自動(dòng)點(diǎn)樣儀進(jìn)行條帶狀點(diǎn)樣，為了確保帶狀點(diǎn)樣的可操作性，點(diǎn)樣前需要將供試品溶液過0.45 μm微孔濾膜。條帶狀點(diǎn)樣量為10 μL，如果采用手動(dòng)點(diǎn)狀點(diǎn)樣，點(diǎn)5 μL即可。點(diǎn)樣后將薄層板放置于有五氧化二磷的真空干燥器中，減壓干燥1 h后再展開，以控制薄層板的濕度，達(dá)到較好的分離效果。

3.3 含量測(cè)定項(xiàng)

采用HPLC法測(cè)定蒙花苷的含量，參照文獻(xiàn)報(bào)道[13-17]，曾比較了流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸（25∶75）、乙腈-0.05%磷酸梯度洗脫、甲醇-0.1%磷酸（55∶45）、乙腈（A）-0.1%磷酸（B）水溶液梯度洗脫、乙腈-1.0%醋酸水溶液梯度洗脫、甲醇-水-冰醋酸（52∶46∶2），結(jié)果乙腈-2%冰醋酸水溶液（21∶79）為流動(dòng)相的分離效果最佳，且陰性無干擾。蒙花苷為黃酮類成分，在紫外區(qū)有明顯吸收，根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版一部“野菊花”含量測(cè)定項(xiàng)下以及蒙花苷的光譜圖，選擇確定檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm。

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（收稿日期：2015-01-05 本文編輯：張瑜杰）