趙志坤等

[摘要] 目的 研究慢性應(yīng)激狀態(tài)對(duì)老年性骨質(zhì)疏松癥病變程度的影響，為老年性骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 選取SPS級(jí)快速老化小鼠SAM-P6（3月齡，雄性）24只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（n = 12），實(shí)驗(yàn)組每日給予不可預(yù)見性慢性溫和應(yīng)激，對(duì)照組正常飼養(yǎng)，4周后檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)和micro-CT各項(xiàng)參數(shù)，綜合評(píng)估骨代謝水平和骨強(qiáng)度。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)4周末，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重比實(shí)驗(yàn)開始時(shí)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組血鈣、堿性磷酸酶水平均顯著增加（P < 0.05），血清骨鈣蛋白水平明顯降低（P < 0.05），而血清Ⅰ型膠原氨基末端肽水平顯著增加（P < 0.05），骨密度明顯降低（P < 0.05），骨小梁相對(duì)體積顯著降低（P < 0.01），骨小梁數(shù)目明顯減少（P < 0.05）。 結(jié)論 慢性應(yīng)激狀態(tài)加劇骨丟失，降低骨強(qiáng)度，加重老年性骨質(zhì)疏松癥嚴(yán)重程度，在老年性骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療過程中應(yīng)予以重視。

[關(guān)鍵詞] 應(yīng)激；骨質(zhì)疏松；骨密度；骨微結(jié)構(gòu)

[中圖分類號(hào)] R681 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）06（c）-0026-04

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨密度降低、骨組織結(jié)構(gòu)改變?yōu)樘攸c(diǎn)，導(dǎo)致骨正常負(fù)載功能減弱和骨折危險(xiǎn)性增加的一種綜合征[1-3]，多見于老年人。老年性骨質(zhì)疏松癥是常見的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥類型。目前我國(guó)人口老齡化現(xiàn)象正呈現(xiàn)快速發(fā)展態(tài)勢(shì)，如何預(yù)防和治療老年性骨質(zhì)疏松癥，具有重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。研究表明，抑郁是骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)因素，導(dǎo)致骨量減少[4]。但是，應(yīng)激狀態(tài)對(duì)老年性骨質(zhì)疏松癥疾病進(jìn)程的影響尚需要進(jìn)一步研究。本研究旨在探討慢性應(yīng)激狀態(tài)對(duì)老年性骨質(zhì)疏松癥病變程度的影響，為老年性骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)快速老化小鼠SAM-P6（3月齡，雄性）24只，平均體重為（21.28±0.27）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SAM鼠繁育屏障系統(tǒng)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為SCXR（京）2012-0004。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在同等環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，予以正常飲食，環(huán)境溫度（23±1）℃，平均相對(duì)濕度55%，每天光照與黑暗各12 h循環(huán)交替，飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與取材

按照隨機(jī)數(shù)字表法，將所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組，即實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組12只。實(shí)驗(yàn)組給予不可預(yù)見性慢性溫和應(yīng)激（unpredictable chronic mild stress，UCMS），按照Mineur等[5]的方法并加以改進(jìn)制備UCMS小鼠模型，每天隨機(jī)選取刺激時(shí)間，并隨機(jī)給予下列應(yīng)激刺激之一：電擊足底（10 mA，間隔1 min刺激l次，共30次）；晝夜顛倒（24 h）；冰水游泳（8℃，15 min）；熱刺激（電暖器照明15 min）；去除墊料（24 h）；變換飼養(yǎng)環(huán)境溫度（24 h更替）；傾斜鼠籠（24 h）；置于塑料管限制活動(dòng)（60 min）；夾尾（2 min）。同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，持續(xù)4周。對(duì)照組不給予任何刺激，正常飼養(yǎng)。在持續(xù)給予刺激4周后，禁食12 h，對(duì)各組小鼠摘除眼球取血，通過頸椎脫臼法處死后，迅速剝離股骨，盡量剔除附著的肌肉等軟組織，注意避免損傷骨皮質(zhì)，留取完整的股骨段，用生理鹽水浸透的紗布包裹后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

采用邁瑞B(yǎng)S-220全自動(dòng)化生化分析儀測(cè)定血清中鈣、磷和堿性磷酸酶（ALP）的含量。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒檢測(cè)血清骨鈣蛋白及Ⅰ型膠原氨基末端肽（NTx）水平，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 micro-CT檢測(cè)

將備用股骨樣本在室溫下解凍后，置于micro-CT系統(tǒng)（GE公司）的檢測(cè)管內(nèi)，在高分辨率下沿標(biāo)本長(zhǎng)軸方向掃描，掃描厚度為20 μm，獲取連續(xù)的micro-CT圖像。在完成掃描后重建整體結(jié)構(gòu)，選取股骨近端骨組織為興趣區(qū)域（region of interests，ROI），采用三維直接測(cè)量法分析骨微結(jié)構(gòu)各項(xiàng)參數(shù)，包括骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁相對(duì)體積（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁數(shù)目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（structure model index，SMI）等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠的一般狀況

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均進(jìn)入結(jié)果分析，無脫落。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平均體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。在給予應(yīng)激刺激4周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠體重略低于對(duì)照組，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；與實(shí)驗(yàn)前相比，實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)4周末的體重明顯下降（P < 0.05），而對(duì)照組未見明顯改變（P > 0.05）。見表1。

2.2 兩組小鼠血清學(xué)指標(biāo)比較

實(shí)驗(yàn)4周末，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清鈣、ALP含量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而血磷水平雖然有一定程度的升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。對(duì)骨形成相關(guān)特異性標(biāo)志物進(jìn)行血清學(xué)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組血清骨鈣蛋白水平明顯降低，而血清NTx水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見表3。

2.3 兩組小鼠micro-CT檢測(cè)指標(biāo)比較

實(shí)驗(yàn)4周末，實(shí)驗(yàn)組BMD明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組BV/TV顯著降低（P < 0.01），Tb.N減少（P < 0.05）；Tb.Th呈降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；Tb.Sp呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。

3 討論

快速老化小鼠SAM-P6是經(jīng)典的老年性骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型，其在6～8周即可明顯老化[6]。為排除雌激素水平變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能造成的干擾，本實(shí)驗(yàn)選擇雄性SAM-P6進(jìn)行研究，觀察慢性應(yīng)激狀態(tài)對(duì)老年性骨質(zhì)疏松癥病理生理變化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢性應(yīng)激狀態(tài)會(huì)改變骨質(zhì)疏松癥相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)，加重骨質(zhì)疏松狀態(tài)，說明慢性應(yīng)激狀態(tài)在骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制、病程進(jìn)展及治療過程中可能發(fā)揮重要作用。

鈣是骨礦化的基本物質(zhì)，而磷促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和骨礦沉積，影響骨細(xì)胞對(duì)鈣的攝入，導(dǎo)致骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，兩者相互影響，血鈣、血磷的穩(wěn)定是骨生長(zhǎng)和礦化的必要條件。本實(shí)驗(yàn)處于應(yīng)激狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)組血鈣、血磷均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，可能與應(yīng)激引發(fā)的神經(jīng)內(nèi)分泌改變和骨代謝紊亂有關(guān)[7-9]。

ALP是在骨礦化過程中扮演重要角色的非膠原蛋白[10]，在成骨活躍時(shí)可由成骨細(xì)胞大量分泌。血清中約有50%的ALP來源于骨，因此血清ALP含量在一定程度上可反映骨的代謝變化。研究表明，當(dāng)存在快速骨質(zhì)丟失或骨折風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，血清ALP水平呈增高趨勢(shì)，可能是由伴隨著骨吸收亢進(jìn)而出現(xiàn)的代償性骨形成和骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng)引起的[11-12]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組血清ALP水平顯著高于對(duì)照組，提示處于慢性應(yīng)激狀態(tài)時(shí)骨轉(zhuǎn)換率明顯增加。

通過檢測(cè)血清或尿液中各項(xiàng)比較敏感的骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物，將有助于更加明確機(jī)體的骨代謝狀態(tài)[13]。骨鈣蛋白在骨代謝過程中主要由成骨細(xì)胞合成和分泌，是反映成骨細(xì)胞活性的血清學(xué)特異性敏感指標(biāo)[14-15]，其特異性不受骨代謝紊亂的影響。NTx是礦化骨中Ⅰ型膠原降解產(chǎn)生的交聯(lián)物的一部分，在骨吸收時(shí)釋放入血，部分出現(xiàn)于尿液中，是特異性地反映骨吸收狀態(tài)的敏感指標(biāo)[16]。通過檢測(cè)小鼠血清中骨鈣蛋白和NTx水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，處于慢性應(yīng)激狀態(tài)的小鼠，其血清骨鈣蛋白水平顯著降低，而NTx水平明顯升高，提示實(shí)驗(yàn)組小鼠成骨減少，破骨增加，骨轉(zhuǎn)化率增加，說明慢性應(yīng)激狀態(tài)不利于骨代謝正常和穩(wěn)定水平的維持。

骨密度降低和骨結(jié)構(gòu)異常是骨質(zhì)疏松癥的重要特征[2]。為直觀觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨量丟失程度和骨結(jié)構(gòu)改變情況，micro-CT是目前最常用的影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)之一[17]。該技術(shù)不僅能檢測(cè)骨密度的變化，還可以對(duì)骨質(zhì)量改變進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，相對(duì)傳統(tǒng)的雙能X線吸收測(cè)量法（DEXA）具有明顯的優(yōu)勢(shì)。通過該技術(shù)，筆者對(duì)近端股骨這一骨質(zhì)疏松癥常見骨折部位進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠除了BMD明顯降低外，同時(shí)BV/TV、Tb.N等骨質(zhì)量參數(shù)也發(fā)生明顯負(fù)性改變，說明慢性應(yīng)激狀態(tài)可改變骨強(qiáng)度，加重骨質(zhì)疏松癥骨微觀結(jié)構(gòu)的改變。

本研究尚存在一些不足之處。此次實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間為4周，相對(duì)較短；未進(jìn)一步行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)、骨生物力學(xué)測(cè)量等，以更加全面評(píng)估實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨質(zhì)改變情況；采用SAM-P6作為老年性骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型，僅能反映人體老化的部分特征，因此仍然需要進(jìn)一步進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)。

綜上所述，通過本次實(shí)驗(yàn)研究對(duì)骨代謝狀態(tài)指標(biāo)和骨質(zhì)量等的綜合分析，初步認(rèn)為，慢性應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致老年性性骨質(zhì)疏松癥病變程度的加重，長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)將不利于老年性性骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療。因此，對(duì)于長(zhǎng)期忍受病痛折磨或精神壓力的老年性患病人群，尤其應(yīng)當(dāng)注意重度骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防。在治療過程中，應(yīng)當(dāng)按照生物-心理-社會(huì)醫(yī)學(xué)模式的要求，給予老年人群良好的人文關(guān)懷和積極的心理干預(yù)。

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（收稿日期：2015-03-24 本文編輯：程 銘）