吳艷鳳 李德濤 鄭 倩 李 雪 薛成軍 陳 輝 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，重慶 400016)

表觀遺傳學(xué)調(diào)控是腫瘤細胞對順鉑獲得性耐藥產(chǎn)生的重要途徑之一，甲基化是表觀遺傳修飾的重要方式，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)是甲基化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶，是基因表達的重要調(diào)控因子〔1〕。在哺乳動物細胞中，具有催化活性的DNMTs有三個亞型，分別為 DNMT1、DNMT3a和 DNMT3b，其中 DNMT3a和DNMT3b在哺乳動物的發(fā)育和甲基化形成階段發(fā)揮重要作用〔2〕，DNMT3a是DNMTs中的重要成員之一，在新形成甲基化時發(fā)揮關(guān)鍵作用。新近研究發(fā)現(xiàn)DNMT3a及其調(diào)控的多基因異常甲基化所致腫瘤細胞抗凋亡途徑激活是影響放療和化療敏感性的重要因素。前期研究中發(fā)現(xiàn)DNMT3a在順鉑耐受的同源A549細胞(A549-DDP)中的表達水平明顯高于親本A549細胞中的表達〔3〕，本研究擬通過利用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計以DNMT3a的mRNA保守序列為靶點的shRNA序列，通過pGenesil-1載體構(gòu)建攜帶DNMT3a shRNA的真核表達載體，為進一步研究DNMT3a在A549-DDP細胞中的過表達與其對順鉑化療耐受關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株 肺腺癌A549細胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院惠贈，A549-DDP是在人肺腺癌細胞A549的基礎(chǔ)上，以順鉑作為誘導(dǎo)藥物，采用逐步遞增濃度的方法誘導(dǎo)獲得，在常規(guī)培養(yǎng)中使用2 μg/ml的順鉑維持其耐藥性狀。

1.2 主要試劑 pGensil-1質(zhì)粒由重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院涂植光教授惠贈，克隆用的大腸桿菌DH5a由本實驗室保存，T4 DNA Ligdase、BamHⅠ、HinDⅢ、PstⅠ購自 TakaRa 公司，RPMI-1640培養(yǎng)基與胎牛血清購自美國Hyclon公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司，annealing緩沖液購自碧云天生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 DNMT3a靶向siRNA設(shè)計與合成 Genbank中找到針對人DNMT3a的mRNA核苷酸序列(共有三個不同剪切體，GenBank No.NM_175629.1，NM_153759.2，NM_022552.3)。選擇催化區(qū)保守序列的共同片斷作為目的基因，參考shRNA設(shè)計原則，正義鏈帶有 BamHⅠ的限制性酶切位點，反義鏈帶有HinDⅢ的酶切位點，應(yīng)用 BLAST進行同源序列對比后設(shè)計1條shRNA序列和1條無效干擾序列(HK)，通過BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)同源性比對分析以排除其他具有同源性的其他基因。根據(jù)BamHⅠ+Sense+Loop+Antisense+終止信號+HinDⅢ的結(jié)構(gòu)，設(shè)計序列如下:shRNADNMT3a-A:5'-GATCCCCAGATGTTCTTCGCTAATCTATGGACAA TTAGCGAAGAACATCTGGTTTTTTA-3';shRNA-DNMT3a-B:5'-AGCTTAAAAAACCAGATGTTCTTCGCTAATTGTCCATAGATTAG CGAAGAACATCTGGG-3';shRNA-HK-A:5'-GATCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGTC TTTTTTA-3';shRNA-HK-B:5'-AGCTTAAAAAAGACTTCATAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATGCGCCTTATGAAGTCG-3'，寡 核苷酸序列由上海英駿(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.2 構(gòu)建步驟 ①單鏈目的基因片段的退火連接:各用一定量annealing緩沖液溶解合成1 OD單鏈目的基因片段至0.01 nmol/μl，分別取 5 μl shRNA-DNMT3a-A 與 5 μl shRNADNMT3a-B 及 5 μl shRNA-HK-A 與 5 μl shRNA-HK-B 混勻，94℃水浴緩慢退火冷卻至室溫。②質(zhì)粒 pGenesil-1用BamHⅠ+HinDⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，回收大片段。③退火片段分別與線性化pGenesil-1質(zhì)粒載體利用T4 DNA連接酶16℃過夜連接。④各取5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，分別涂布于含卡那霉素(終濃度50 μg/ml)的LB平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。⑤從培養(yǎng)皿上挑取2個陽性菌落接種于5 ml含卡那霉素(終濃度50 μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，振搖12～16 h。⑥用小提試劑盒小量提取質(zhì)粒，質(zhì)粒分別用 BamHⅠ，HinDⅢ，PstI做酶切鑒定，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查。

1.3.3 重組質(zhì)粒進行測序鑒定 將初步鑒定證實后的細菌常規(guī)培養(yǎng)擴增，保存菌液，并提取質(zhì)粒，分別取質(zhì)粒和菌液送上海invitrogen公司測序。

1.3.4 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)A549-DDP細胞24 h，0.25% 胰酶消化貼壁A549-DDP細胞，新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基中和胰酶并收集細胞，室溫500 r/min離心5 min，棄上清，并用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，用牛鮑氏計數(shù)板計數(shù)，按照每孔2×105個細胞鋪6孔板，37℃、5%CO2分別培養(yǎng)24 h后，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說明書將2 μl轉(zhuǎn)染試劑+1 μg DNA分別轉(zhuǎn)染pGenesil-1-DNMT3a-shRNA和pGenesil-1-HK-shRNA，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h在倒置熒光顯像鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.3.5 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前后DNMT3a mRNA水平 用Trizol法提取轉(zhuǎn)染后24、48、72 h總RNA，分光光度法檢測RNA濃度。參照文獻〔4，5〕設(shè)計引物，其中GAPDH為內(nèi)參基因。取500 ng總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA序列，然后進行PCR反應(yīng)，條件如下:95℃預(yù)變性，5 min，94℃變性，30 s，58℃ 退火，30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min。GAPDH以相同條件反應(yīng)35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳30 min。

2 結(jié)果

2.1 載體的酶切鑒定 將pGenesil-1載體用BamHⅠ和HinDⅢ進行雙酶切，回收產(chǎn)物進行電泳檢查，環(huán)狀質(zhì)粒被切開形成大小兩個片段，大片段為4 870 bp，小片段為30 bp(因太小跑出膠外而未見成像)，見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 質(zhì)粒pGenesil-1的多克隆位點(MCS)如下:-HindⅢ-XbaⅠ-SalⅠ-PstⅠ-BamHⅠ-U6 Promotor-EcoRⅠ-SalⅠ-X baI-DraⅢ，pGenesil-1質(zhì)?？杀?PstⅠ切開，而在重組質(zhì)粒中由于外源性寡核苷酸片段插入成功后PstⅠ位點被取代，重組質(zhì)粒不能被切開，見圖2。

圖1 BamHⅠ和HinDⅢ雙酶切環(huán)狀質(zhì)粒pGenesil-1結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒PstⅠ酶切鑒定結(jié)果

2.3 重組質(zhì)粒測序鑒定 重組質(zhì)粒(pGenesil-1-DNMT3a-shRNA、pGenesil-1-HK-shRNA)的測序結(jié)果與合成序列完全相同，成功構(gòu)建兩組質(zhì)粒。

2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率鑒定 由于pGenesil-1質(zhì)粒中帶有編碼綠色熒光蛋白的基因，若轉(zhuǎn)染成功則可在細胞內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光蛋白。將 pGenesil-1-DNMT3a-shRNA、pGenesil-1-HK-shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549-DDP細胞24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察，成功轉(zhuǎn)染的細胞中出現(xiàn)綠色熒光(圖3)，重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細胞。

2.5 重組質(zhì)粒重組效率驗證 利用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染pGenesil-1-DNMT3a-shRNA 24、48、72 h后 DNMT3a在 mRNA 水平的變化，轉(zhuǎn)染后DNMT3a mRNA水平顯著降低，并呈明顯的時間依賴性，抑制率分別為25.5%，56.2%，63.4%，而轉(zhuǎn)染pGenesil-1-HK-shRNA組DNMT3a在mRNA水平無明顯變化，見圖4。

圖3 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒24 h后A549-DDP細胞(×200)

圖4 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前后DNMT3a mRNA水平變化

3 討論

RNA干擾(RNAi)作為一種選擇性抑制特殊基因表達的技術(shù)是研究疾病發(fā)病機制與基因表達最常用的手段之一〔6〕。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后抑制，在RNA干擾的效應(yīng)階段，不同來源的 dsRNA 在 Dicer作用下產(chǎn)生21～23nt的 siRNA〔7〕，siRNA 與核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，在ATP酶作用，激活的RISC通過堿基配對定位至對應(yīng)的mRNA上，導(dǎo)致mRNA同源依賴性降解〔8〕，從而使細胞表現(xiàn)出特定基因表型缺失。RNAi的發(fā)現(xiàn)改變了人們對細胞基因調(diào)控的傳統(tǒng)理解，為特異性阻斷基因表達、評價基因功能及研究腫瘤發(fā)病機制提供了新策略。研究證實 RNAi主要通過 microRNA、shRNA、siRNA〔9〕三種途徑完成。而目前廣泛應(yīng)用的RNAi技術(shù)則主要通過體外化學(xué)合成和載體介導(dǎo)的體內(nèi)合成來實現(xiàn)，前者是通過人工合成針對特定靶基因的siRNA序列，然后通過一定的手段轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)發(fā)揮干擾作用，此法操作簡單，但體外合成的siRNA易被細胞內(nèi)的RNA酶降解，且還可隨細胞的增殖逐漸被稀釋導(dǎo)致干擾效率低，干擾持續(xù)時間短，體內(nèi)合成則由質(zhì)粒和病毒等載體介導(dǎo)，病毒載體成本高、對細胞毒性大，操作時需要有較高的精確度;質(zhì)粒載體則具有經(jīng)濟便利和制備質(zhì)量可控性好等優(yōu)點，不僅可在原核生物細胞內(nèi)進行大量擴增，還可真核細胞中持續(xù)擴增并發(fā)揮特異性抑制靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄和其蛋白的表達，持續(xù)時間可達數(shù)星期甚至更久〔10〕，是目前RNAi最常用的方式。

本實驗中使用的載體是含有U6啟動子和RNA聚合酶Ⅲ啟動子的pGenesil-1載體，U6啟動子可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA，本次實驗中設(shè)計的分隔正義和反義片段的9個堿基互補可折返形成短發(fā)卡狀雙鏈RNA，這種短發(fā)卡狀RNA結(jié)構(gòu)可被細胞內(nèi)酶切割成siRNA后引發(fā)特定靶基因沉默。同時，U6啟動子在真核細胞中可以精確地識別RNA的轉(zhuǎn)錄起始和終止位置，并且U6啟動子能被RNA聚合酶Ⅲ識別合成RNA，確保shRNA總是表達，此外，U6啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位置剛好被限制性內(nèi)切酶切斷，可直接插入 shRNA序列，在轉(zhuǎn)錄后不需切除多余的堿基。保證了插入序列的高效性和高度特異性。RNA聚合酶Ⅲ系統(tǒng)的關(guān)鍵優(yōu)勢在于轉(zhuǎn)錄過程可被中止序列(TTTTT)準(zhǔn)確中止。有研究證實RNA聚合酶Ⅲ啟動子和 shRNA編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞時，這種能表達siRNA的質(zhì)?？梢韵抡{(diào)包括外源基因和內(nèi)源基因在內(nèi)的特定基因的表達〔11〕。此外，pGenesil-1重組質(zhì)粒載體導(dǎo)入細胞后相對穩(wěn)定可傳遞到子代細胞中去，使抑制靶基因可被遺傳，同時該載體還帶卡那霉素和新霉素(G418)篩選標(biāo)記，能夠快速原核篩選出陽性克隆菌株，并且可經(jīng)長期篩選獲得穩(wěn)定的DNMT3a表達缺失的細胞株，此外，該載體還帶有編碼綠色熒光蛋白的基因序列，可通過熒光實時監(jiān)測重組質(zhì)粒在細胞內(nèi)的表達和定位。

本實驗成功構(gòu)建了攜帶干擾DNMT3a基因表達的RNAi序列的pGenesil-1-shRNA-DNMT3a重組質(zhì)粒，經(jīng)體外擴增后可直接轉(zhuǎn)染細胞進行基因沉默，有效的干擾了DNMT3a在A549-DDP細胞株中的表達，克服了以往應(yīng)用化學(xué)合成法進行RNAi干擾技術(shù)研究基因功能的瞬時性干擾的缺陷〔12〕，為后續(xù)研究DNMT3a在A549-DDP中的過表達與肺癌對順鉑耐受關(guān)系奠定基礎(chǔ)，同時也為肺癌順鉑化療耐受的基因治療提供新途徑。

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