費文斌　雍曉雨　徐俊等

摘要：以江蘇省灌南縣湯溝釀酒廠的大曲、窖泥及發(fā)酵酒醅為樣品，經(jīng)富集、分離得到18株初篩酵母菌株，從中經(jīng)復(fù)篩分離出1株能在42 ℃下發(fā)酵產(chǎn)乙醇的酵母菌，命名為NR11。經(jīng)過形態(tài)觀察、BIOLOG微生物檢定系統(tǒng)以及18S rDNA基因的分析，將該酵母菌鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。對其特性及發(fā)酵性能的研究結(jié)果顯示，NR11可以在12%乙醇溶液及55%糖溶液下正常發(fā)酵，致死溫度可達60 ℃，在30、38、40、42 ℃條件下，乙醇產(chǎn)量分別可以達到109.0、93.2、73.8、44.0 g/L。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母；富集；分離；性能測試；菌株鑒定；耐熱性；乙醇

中圖分類號： TS261.1 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0319-04

乙醇為一種可再生的清潔能源，可用作液體燃料替代或部分替代石油燃料，并且其生產(chǎn)工藝成熟，原料來源廣泛[1-3]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是使用最廣泛的乙醇發(fā)酵出發(fā)功能菌株，然而傳統(tǒng)的釀酒酵母的最適發(fā)酵溫度為28～33 ℃，一般不超過36 ℃，因此在氣溫較高地區(qū)和夏季會嚴重影響正常生產(chǎn)。研究顯示，應(yīng)用耐高溫酵母生產(chǎn)乙醇具有節(jié)約能源、提高出酒率、縮短發(fā)酵周期、提高設(shè)備利用率及維持高溫下正常生產(chǎn)等諸多優(yōu)勢[4]。耐高溫高產(chǎn)乙醇酵母菌的選育和發(fā)酵工藝的改進是實現(xiàn)濃醪發(fā)酵工業(yè)的關(guān)鍵，因此分離、篩選和應(yīng)用耐高溫高產(chǎn)乙醇酵母菌的研究已經(jīng)受到廣泛重視，成為當(dāng)前國內(nèi)外乙醇生產(chǎn)行業(yè)研究的熱點[5-7]。

白酒的傳統(tǒng)釀造過程是以含有復(fù)雜微生物種類的酒曲作為發(fā)酵劑，以淀粉質(zhì)、糖質(zhì)為原料，在窖池中完成乙醇發(fā)酵的過程。在發(fā)酵過程中，窖泥和發(fā)酵糟醅密封接觸，大量微生物在兩者間擴散、交換，最終使得作為發(fā)酵容器的窖泥中含有包括酵母菌在內(nèi)的非常豐富的微生物種群。這些微生物在白酒生產(chǎn)后期，能利用含高濃度乙醇的酒醅進行發(fā)酵，并且發(fā)酵溫度高，經(jīng)過長期馴化可以具有比其他環(huán)境微生物更強的耐高溫、耐乙醇能力[8-9]，因此白酒廠窖池中的窖泥、酒曲成為分離選育酵母菌及其他微生物的良好來源[10]。本試驗旨在通過初篩、復(fù)篩試驗得到可以耐高溫并且高產(chǎn)乙醇酵母，并對耐高溫酵母的生理特性及發(fā)酵性能進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為大曲、窖泥、發(fā)酵酒醅，由江蘇省灌南縣湯溝釀酒廠提供。

1.2 培養(yǎng)基

YEPD液體培養(yǎng)基：20.0 g/L葡萄糖、20.0 g/L酵母粉、20.0 g/L蛋白胨；

YEPD固體培養(yǎng)基：20.0 g/L葡萄糖、20.0 g/L 酵母粉、20.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L瓊脂；

酵母富集培養(yǎng)基：含10%乙醇的6Be°麥芽汁，pH值自然；

初篩培養(yǎng)基由上下2層培養(yǎng)基組成；下層培養(yǎng)基為YEPD固體培養(yǎng)基，上層培養(yǎng)基主要成分包括0.3 g/L紅四氮唑（TTC）、30.0 g/L葡萄糖、20.0 g/L瓊脂；乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基：250.0 g/L葡萄糖、4.0 g/L蛋白胨、3.0 g/L 酵母粉、4.0 g/L （NH4）2SO4、3.0 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4、0.05 g/L ZnSO4、0.05 g/L ZnSO4 、0.05 g/L FeSO4。

1.3 篩選方法

酵母分離樣品的采集：從酒廠窖泥、酒曲、酒醅中以隨機取樣原則收集樣品，裝入滅菌紙袋中，貯存于冰箱中備用。

樣品的預(yù)處理：分別將10.0 g大曲、窖泥、酒醅樣品加入50 mL裝有滅菌玻璃珠的無菌水中，200 r/min處理30 min以打碎樣品。

酵母菌的富集：取5.0 mL各樣品懸液接入酵母富集培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，以富集樣品中的酵母；6 h 后轉(zhuǎn)成40 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)18 h，以富集其中的耐熱酵母菌株。

一級篩選：將富集的菌液涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，于40 ℃培養(yǎng)24 h，長出菌落后倒入45 ℃ TTC上層培養(yǎng)基中，于40 ℃下避光保溫6 h。比較各菌株顏色，顏色呈深紅色的即具有較高的產(chǎn)乙醇能力。挑取明顯的酵母菌落，多次劃線得到單菌落，鏡檢并觀察記錄菌體形狀、大小、出芽情況、菌落大小等。

二級篩選：將一級篩選酵母菌分別接入帶有杜氏小管的不同的YEPD液體試管中，在不同溫度下培養(yǎng)，分別在12、24、48 h觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況。

三級篩選：過夜培養(yǎng)各酵母菌株，按體積分數(shù)為20%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，測定D600 nm值、殘?zhí)呛?、乙醇含量?/p>

1.4 酵母菌的鑒定

1.4.1 BIOLOG鑒定 BIOLOG代謝指紋分析：將菌株在BIOLOG專用酵母培養(yǎng)基上培養(yǎng)約48 h，制備菌懸液，調(diào)整吸光度至合適范圍，上樣于96孔微鑒定板，于30 ℃培養(yǎng)。分別在24、48、72 h使用BIOLOG微生物鑒定儀讀取數(shù)據(jù)，將該菌株對95種碳源的利用率與數(shù)據(jù)庫中的信息進行比對，得出鑒定結(jié)果[11]。

1.4.2 18S rDNA基因序列鑒定 18S rDNA基因擴增和測序：使用OMEGA公司的Yeast DNA Kit試劑盒提取該菌株的基因組DNA，利用通用引物（上游：5′-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3′，下游：5′-GGAAGGGATGTATTTATTAG-3′）進行PCR擴增[12]，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，最后將測序結(jié)果進行BLAST比對。

1.5 酵母菌性能測試

耐熱性能：將菌株按體積分數(shù)為10%的接種量接入到種子培養(yǎng)基中，在37、40、43、45 ℃下培養(yǎng)24 h，測定其生物量。endprint

耐糖性能：分別制備初始葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%的培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)24 h，測定其生物量。

耐酸性能：制備初始pH值分別為2、3、4、5、6的YEPD培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定其生物量。

耐醇性能：制備初始乙醇體積分數(shù)分別為6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的YEPD培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng) 24 h，測定其生物量。

致死溫度測定：將裝有1 mL已培養(yǎng)菌液的試管，分別置于52、54、56、58、60 ℃條件下維持5 min后馬上冷卻，取 0.1 mL 菌液涂布于YEPD平板上，觀察菌落生長情況，如果沒有菌落生長則表示該溫度為該菌的致死溫度。

1.6 分析方法

生物量的測定：采用比濁法，將發(fā)酵液混勻后稀釋成一定倍數(shù)，測定其在波長600 nm下的吸光度（D600 nm）。

殘?zhí)?、乙醇含量的測定：利用SBA-40E生物傳感儀（山東省科學(xué)院生物研究所）進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫酵母菌的初篩

TTC是1種顯色劑，它對酵母的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生呈色反應(yīng)，因此通過它可以判斷酵母中呼吸酶的活力，即酵母產(chǎn)乙醇的能力。經(jīng)過二級篩選和鏡檢，獲得18株顏色最紅且菌落較大的酵母菌落，杜氏管產(chǎn)氣能力強的酵母菌株編號為NR01至NR18，觀察記錄菌體形狀、出芽情況、是否有裂殖現(xiàn)象、是否形成假菌絲，同時測定其細胞大小，結(jié)果如表1所示。

2.2 耐高溫酵母菌的復(fù)篩

將過夜培養(yǎng)的各酵母菌按體積分數(shù)20%接入到復(fù)篩培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。從圖1可以看出，發(fā)酵48 h后，在37 ℃培養(yǎng)條件下，菌株NR11的乙醇質(zhì)量濃度最高，達到 98 g/L，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為11.2 g/L，D600 nm達到18.9，乙醇得率為76.7%，各方面性能均是18株初篩酵母菌中性能最佳的。因此，選取NR11進行下一步鑒定及性能測試試驗。

2.3 酵母菌的種屬鑒定結(jié)果

2.3.1 BIOLOG鑒定結(jié)果 與傳統(tǒng)鑒定方法相比，BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)快速、便捷、有效，在微生物鑒定技術(shù)上是一個很大的進步，由于其數(shù)據(jù)庫范圍廣、包含全面，為廣大的微生物工作者提供了方向性指導(dǎo)[11]。此外，儀器在鑒定結(jié)束時會給出與數(shù)據(jù)庫最匹配的4個結(jié)果，根據(jù)P值從大到小排序，最佳試驗結(jié)果見表2。由表2可以看出，相似度=0967>0.75，距離=0.471<5.0，P值為0.999。系統(tǒng)得到的3個重要參數(shù)比較理想，與數(shù)據(jù)庫匹配良好，相似度越接近100，說明鑒定結(jié)果的可靠性更高。在ID地址欄顯示出1個最佳匹配名稱，物種名為Saccharomyces cerevisiae（釀酒酵母）。各種數(shù)據(jù)指標(biāo)都表明，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，與數(shù)據(jù)庫有很好的匹配。

2.3.2 18S rDNA菌株鑒定結(jié)果 18S rDNA作為一種經(jīng)典的鑒定方式在真菌的鑒定工作中占有重要作用，用于擴增18S rRNA基因片段的PCR引物是根據(jù)真菌18S的保守區(qū)域設(shè)計的。通過PCR對酵母18S rRNA 基因片段進行擴增并測序，再對測序結(jié)果進行多態(tài)性分析，從而將待測酵母正確分類[12]。本試驗將目標(biāo)菌株的18S rRNA基因上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫并進行BLAST比對，下載相關(guān)18S基因序列構(gòu)建進化樹，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)比較可知，NR11與釀酒酵母的同源性為100%，因此，綜合形態(tài)觀察、BIOLOG微生物檢定系統(tǒng)以及18S rDNA基因的分析結(jié)果，將該酵母菌鑒定為1株釀酒酵母，并命名為釀酒酵母NR11。

2.4 酵母菌性能測試

2.4.1 溫度對酵母菌生長影響 溫度在酵母的生長及發(fā)酵過程中起至關(guān)重要的作用。在低溫范圍內(nèi)，溫度越高，酶促反應(yīng)越快，酵母生長代謝越快，乙醇提前生成，產(chǎn)量也進一步提高；當(dāng)溫度超過最適溫度后，高溫抑制酵母細胞生長，表現(xiàn)出酵母易衰老、相關(guān)酶類易失活、細胞膜穩(wěn)定性降低等，從而延長發(fā)酵周期，并影響發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量[10]。從圖3可見，菌株NR11的最適生長溫度為37 ℃，此時D600 nm 最高達到了19.84；菌株NR11在40 ℃ 下也有較好的長勢， D600 nm 值最高達到了17.14；隨著溫度的升高，溫度對酵母生長的抑制作用明顯增強，D600 nm值逐漸降低，45 ℃條件下，酵母菌幾乎沒有生長。

2.4.2 初始糖濃度對酵母菌的影響 初始碳源的濃度對發(fā)酵也會產(chǎn)生影響，在工業(yè)化生產(chǎn)中，糖濃度一般不超過20%，若培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)過于豐富，會導(dǎo)致酵母異常增殖，降低底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的效率，對酵母發(fā)酵會產(chǎn)生不良影響[13]；另外，高糖濃度所產(chǎn)生的高滲透壓也會影響菌體的正常生長、代謝以及發(fā)酵活性[14]。

從圖4可以看出，當(dāng)初始糖濃度在10%～55%的范圍內(nèi)，D600 nm隨著糖濃度的提高而提高；當(dāng)初始糖濃度在60%時，就出現(xiàn)抑制作用。目前，從天然環(huán)境分離得到的菌株大多只能耐受20%左右的糖濃度，說明菌株NR11具有較強的耐滲透壓能力，可以耐受60%以上的糖濃度所產(chǎn)生的滲透壓。

2.4.3 乙醇濃度對酵母菌生長的影響 乙醇發(fā)酵是利用酵母將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，隨著發(fā)酵的進行，乙醇濃度不斷增加，高濃度乙醇會抑制酵母生長及存活率，并影響一些運輸系統(tǒng)，如葡萄糖和氨基酸的運輸?shù)?，同時會改變細胞膜的流動性和膜上H+-ATP酶的活性，從而影響酵母細胞的生長和細胞的形態(tài)[15]。

從圖5可以看出，初始乙醇體積分數(shù)越高，D600 nm值越??；當(dāng)初始乙醇體積分數(shù)在6%以上時，對酵母開始有抑制作用；當(dāng)初始乙醇體積分數(shù)在10%以上時，乙醇對酵母生長的抑制明顯增強。這是因為在高溫與高乙醇濃度共同作用下，酵母細胞膜通透性增強，流動性降低，各種酶促反應(yīng)受到抑制，從而對酵母細胞的生長和代謝產(chǎn)生了脅迫作用。endprint

2.4.4 培養(yǎng)基pH值對酵母菌生長的影響 酵母細胞的生長和胞內(nèi)酶促反應(yīng)都需要在一定的pH值環(huán)境中進行，pH值值過高或過低都會影響酵母細胞膜所帶電荷狀態(tài)，使酵母生長代謝受阻[14]。

2.5 不同溫度下菌株NR11的產(chǎn)乙醇能力

分別在30、38、40、42 ℃下，以20%的接種量將NR11接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行厭氧發(fā)酵48 h，試驗結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，在初始糖濃度260.0 g/L條件下發(fā)酵48 h后，30 ℃ 條件下的乙醇含量達到109.0 g/L，殘?zhí)呛繛?4.6 g/L，乙醇得率83.6%；38 ℃條件下，乙醇含量達到 93.2 g/L，殘?zhí)呛繛?0.4 g/L，乙醇得率72.9%；40 ℃條件下，乙醇含量達到73.8 g/L，殘?zhí)呛繛?.5 g/L，乙醇得率670%；43 ℃條件下乙醇含量達到44.0 g/L，殘?zhí)呛繛?21.7 g/L，乙醇得率34.4%。

3 結(jié)論

經(jīng)過初篩和復(fù)篩，從采自于江蘇省灌南縣湯溝釀酒廠的酒曲樣品中篩選出1株在42 ℃下生長并產(chǎn)乙醇的酵母，命名為NR11。經(jīng)過BIOLOG和18S rDNA鑒定，NR11為釀酒酵母。進一步研究結(jié)果表明，NR11有較強的耐糖和耐熱性，可以在初始糖濃度為60%和42 ℃的高溫下生長，致死溫度也達到60 ℃，在30、38、40、42 ℃下的乙醇產(chǎn)量分別可以達到109.0、93.2、73.8、44.0 g/L，在42 ℃的高溫下仍舊可以生產(chǎn)乙醇，充分顯示其在高溫下發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的潛力巨大。

綜上所述，從酒曲樣品中篩選出的NR11生長旺盛，發(fā)酵能力強，發(fā)酵所得生物量高，耐高溫和高糖，在低pH值下也可以生長以避免雜菌污染，可見其是一株有工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價值的酵母菌株，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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