任敏　吳羽晨　張家洋等

摘要：以金銀花的葉片為外植體，在50組不同濃度IAA、NAA、6-BA組合的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，以探討金銀花的快速繁殖體系的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，IAA和NAA的最佳濃度均為1.0 mg/L，6-BA的最佳濃度為 15 mg/L。確定適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞：愈傷組織；金銀花；組織培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基；配方；IAA；NAA；6-BA；最佳濃度

中圖分類號(hào)： S567.7+90.43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0038-03

金銀花（Lonicera japonica Thunb）別稱銀花、雙花、忍冬、二寶花，是忍冬科忍冬屬多年生半常綠木質(zhì)藤本植物[1-2]。金銀花單葉對(duì)生，葉片卵形或長(zhǎng)卵形，兩面被柔毛；每葉腋內(nèi)由二花組成一小聚傘花序，花兩側(cè)對(duì)稱，花冠唇形，初開(kāi)時(shí)為白色，2～3 d后變成金黃色，故名金銀花[3]，花期為4—6月。金銀花喜溫暖濕潤(rùn)氣候，適應(yīng)性比較強(qiáng)，對(duì)土壤要求不嚴(yán)，耐寒、耐旱、耐澇，除東北、西北等高寒、干旱地區(qū)和海南外，全國(guó)各地均有分布。金銀花全草均可入藥，其主要藥用成分是綠原酸和異綠原酸，具有清熱解毒、除火、消炎等多種功效，主治溫病、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、痛腫潰瘍、痢疾、丹毒、肺炎等癥[4]。金銀花的花蕾含有揮發(fā)性芳香油、皂苷、綠原酸、肌醇和黃酮類化合物等，還含有肉桂酸、茉莉醛、橙花醇等；其莖中含有生物堿；其葉中含有忍冬苷、忍冬素和木樨素等。根據(jù)藥理研究，金銀花對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌、葡萄球菌和肺炎雙球菌等有抑制作用[5-6]，是我國(guó)著名的豫產(chǎn)道地中藥材之一。尤其是在2003年的“非典”時(shí)期，以金銀花為重要成分的中草藥對(duì)“非典”的預(yù)防作用十分顯著。金銀花除了作為用途廣泛的中藥材外，還具有良好的保健作用。此外，金銀花茶香氣宜人，對(duì)防治盛夏中暑、風(fēng)熱感冒、上呼吸道感染和腸胃疾病有良好的效果，可以制作飲料。尤其是對(duì)清除人體自由基、提高人體免疫機(jī)能和延緩衰老等具有良好的作用，因而也是高血壓和心血管系統(tǒng)患者降低膽固醇的保健佳品。金銀花花開(kāi)清香宜人，黃白相間，繁華密布，也是優(yōu)良園林綠化植物。目前，金銀花仍采用傳統(tǒng)的扦插和壓條2種繁育方式[7]，但這些傳統(tǒng)的繁殖方式繁殖速度慢、繁殖系數(shù)低，繁殖的苗木規(guī)格不一，商品化程度不高，不能滿足金銀花優(yōu)良品種迅速推廣種植的需要，因此，如何提高其繁殖速度，增加繁殖系數(shù)，并使其迅速推廣種植已成為金銀花生產(chǎn)中亟待解決的一個(gè)重要問(wèn)題。而國(guó)內(nèi)外對(duì)金銀花的研究多集中在栽培、管理、加工、藥理、制劑等方面，關(guān)于其組織培養(yǎng)、離體快繁的研究[8-9]卻報(bào)道得極少，僅見(jiàn)有鳳爪金銀花[10]和蒙花1、2號(hào)金銀花[11]的組培報(bào)道，但封丘金銀花組培還未見(jiàn)有報(bào)道。本試驗(yàn)以新鄉(xiāng)學(xué)院校園內(nèi)的封丘金銀花品種的葉片為外植體，在不同濃度的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，通過(guò)對(duì)照不同的激素組合，以探索金銀花的愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件，為金銀花的快速繁殖和充分利用打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇

從新鄉(xiāng)學(xué)院校園內(nèi)采集健壯的封丘金銀花幼莖，剪取葉片為外植體進(jìn)行培養(yǎng)。取材時(shí)間為3月中旬至4月下旬。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 配制培養(yǎng)基

試驗(yàn)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度組合共設(shè)計(jì)采用了50組愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1～M50：MS+（0.1～1.5） mg/L IAA/NAA+（0.1～2.0） mg/L 6-BA（表1），每組做3個(gè)對(duì)照。所有培養(yǎng)基均添加3%蔗糖、0.65%瓊脂，調(diào)至pH值至5.8，分裝于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶25 mL，封口后在121 ℃條件下滅菌20 min，并且將重蒸水、鑷子、打孔器、濾紙用聚丙烯薄膜包裝后一并滅菌[12]。待培養(yǎng)基冷凝后，放入超凈工作臺(tái)，紫外線表面滅菌 1 h，準(zhǔn)備接種。

1.2.2 獲得無(wú)菌材料

取新鮮的葉片，先用流水沖洗 30 min，然后放到超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇滅菌30 s，無(wú)菌水沖洗4次，再用0.1% HgCl2滅菌8 min，無(wú)菌水沖洗4次[13-14]，用無(wú)菌濾紙吸干材料表面的水分。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

用打孔器將材料切成大小均勻的若干小圓片，將材料接種在M1～M50培養(yǎng)基上，先經(jīng)暗培養(yǎng)24 h，然后置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)接種30 d后的觀察結(jié)果

以葉片為外植體，葉片切口處有膨大現(xiàn)象最早是第6天，10 d后大多數(shù)成活葉片切口處均有膨大的現(xiàn)象，14 d后有白色顆粒狀的愈傷組織出現(xiàn)。這與趙慧賢等的組培報(bào)道中以葉片為外植體的形成時(shí)間[15]略有差異，這可能與金銀花的品種不一樣有關(guān)。

從愈傷組織組數(shù)觀察結(jié)果（表2）中可以計(jì)算出，在愈傷組織在形成過(guò)程中，150瓶培養(yǎng)瓶中污染率為6.00%，死亡率為18.67%，誘導(dǎo)率為76.99%（誘導(dǎo)率為誘導(dǎo)數(shù)除以除去污染數(shù)和死亡數(shù)的接種總數(shù)）。

2.2 不同濃度的生長(zhǎng)素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果

試驗(yàn)結(jié)果（表3、表4）表明，IAA和NAA都是在0.5～1.0 mg/L 的濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)效果較好。其中又以NAA 濃度為1.0 mg/L 時(shí)效果最好，誘導(dǎo)率最高，達(dá)91.67%。隨著 1.0 mg/L 濃度升高誘導(dǎo)率下降；當(dāng)濃度低于0.5 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)效果也欠佳。IAA濃度為1.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率也較高，達(dá)到88.89%。這與劉連芬等的組培報(bào)道中金銀花愈傷組織形成的最佳生長(zhǎng)素濃度結(jié)果[16]基本一致。

2.3 不同濃度的細(xì)胞分裂素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果

試驗(yàn)結(jié)果（表5、表6）表明，生長(zhǎng)素為IAA或者NAA的情況下，6-BA都是在1.5 mg/L的濃度誘導(dǎo)效果較好，誘導(dǎo)率高達(dá)100%。

2.4 不同生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的效果

接種14 d后，葉片外植體開(kāi)始變綠且變厚，接觸到培養(yǎng)基的外植體表面長(zhǎng)出米粒狀的白色愈傷組織。30 d后，葉片愈傷組織以深褐色和淡黃色為主，深褐色的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，質(zhì)地較硬，呈不透明狀；淡黃色的愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，質(zhì)地松軟，呈透明狀。對(duì)比發(fā)現(xiàn)M3、M8、M15、M16、M17、M19、M22、M24、M29、M31、M34、M39、M42、M44、M47、M49效果較好（表7），生長(zhǎng)速度快且愈傷組織多，其中又以M44（MS+15 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA）效果最好。因此較理想的金銀花愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方是MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。

3 討論

本試驗(yàn)中葉片的污染率（6.00%）較高，可能是因?yàn)槿~片與空氣接觸的時(shí)間較長(zhǎng)，被空氣中的微生物侵染的幾率較大，也可能是因?yàn)樵跍缇^(guò)程中，滅菌劑濃度較低或者滅菌時(shí)間較短；死亡率（18.67%）較高，這可能是因?yàn)槿~片脫毒時(shí)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)葉片組織破壞，也可能是因?yàn)榻臃N時(shí)鑷子在酒精燈上烤燒的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，冷卻較慢，容易燙傷葉片。試驗(yàn)觀察到的2種不同狀態(tài)的愈傷組織，哪一種更適合做傳代培養(yǎng)[17]，這還需要進(jìn)一步研究。此外，因試驗(yàn)條件和試驗(yàn)時(shí)間的限制，本試驗(yàn)接種組數(shù)較少，故其數(shù)據(jù)不具有普遍推廣意義。

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