黃 彭

microRNA-Let-7a及microRNA-34a在肺癌細胞中的抗癌效應(yīng)及其分子機制研究

黃 彭

目的 體外研究分析基因調(diào)控因子微RNA（microRNA）-Let-7a和microRNA-34a在肺癌細胞系中的抗癌效應(yīng)及其相應(yīng)的分子機制。方法在適當?shù)呐囵B(yǎng)基及溫度環(huán)境中培養(yǎng)A549和NCI-H446兩株肺癌細胞系，培養(yǎng)過程中分別轉(zhuǎn)染microRNA-Let-7a和microRNA-34a的2組作為試驗組，并設(shè)定陰性對照組和未轉(zhuǎn)染組，比較每組的細胞周期及細胞凋亡的情況。結(jié)果 在轉(zhuǎn)染的肺癌細胞系中抑制了細胞的增殖，A549細胞系let-7a、34a轉(zhuǎn)染組細胞增殖在48h后明顯被抑制，細胞凋零百分比分別為（11.25±0.252）、（14.07±2.133），NCI-H446兩株細胞系內(nèi)let-7a、34a轉(zhuǎn)染組細胞凋零百分比分別為（10.53±2.171）、（11.97±0.315）。細胞停滯于G0/G1期的百分比明顯升高（P＜0.05），同時誘導了細胞的凋亡。結(jié)論 基因調(diào)控因子microRNA-Let-7a和microRNA-34a在肺癌細胞中能抑制細胞周期，引起細胞凋亡，抗癌效應(yīng)通過下調(diào)bcl2和C-myc及上調(diào)P53的表達水平的分子機制得以實現(xiàn)。

肺癌；microRNA-Let-7a；microRNA-34a；抗癌效應(yīng)

近幾十年關(guān)于肺癌發(fā)病率的報道呈明顯上升的趨勢，在所有腫瘤致死率中居首位。目前，發(fā)現(xiàn)的包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩種組織類型，但尚不完全明確病因機制，人類健康被肺癌嚴重威脅的現(xiàn)狀推動我們開發(fā)新的治療策略，從而能進行有效的治療，挽救患者生命。

微RNA（micro RNA）作為非編碼蛋白的一種，在動、植物的體內(nèi)可廣泛的表達，其長度僅包含17～22個核苷酸，是一種新型的基因調(diào)控因子。近年的研究發(fā)現(xiàn)[1]，micro RNA在肺癌的發(fā)生、發(fā)展，甚至轉(zhuǎn)移的過程中均起重要作用，參與多種細胞的生命活動，包括細胞的生長、發(fā)育、及凋亡等過程，對癌癥可能表現(xiàn)出誘導作用，也可能發(fā)揮抑制作用。microRNA-Let-7家族是目前研究者對其功能較清楚的一類microRNA，microRNA34家族正在被廣泛的研究過程中，二者均與肺癌細胞的發(fā)展過程中起重要作用。因此，本研究圍繞基因調(diào)控因子microRNA-Let-7a和microRNA-34a在肺癌細胞中的作用效果及分子作用機制，進行了分析研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人小細胞肺癌細胞系H446購買自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基購自Gibco公司。

1.1.2 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基購自天津潤泰科技發(fā)展有限公司，胎牛血清購自HyClone公司，甲基纖維素購自Sigma公司，EGF和堿性成纖維生長因子購自PeproTech公司，B27購自Gibco公司，聚2-羥乙基甲基丙烯酸脂購自Sigma公司。

1.2 分組 選用肺癌細胞系2株：A549和NCI-H446，分別分為4組，（1）microRNA-Let-7a和microRNA-34a分別轉(zhuǎn)染的2組作為試驗組；（2）余下的2組，1組作為陰性對照組，另外1組作為未轉(zhuǎn)染組。每組細胞系中，除要求控制的條件外，均在適宜的溫度和環(huán)境下，使用細胞培養(yǎng)液對各組細胞進行培養(yǎng)，一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義。具有可比性。

1.3 方法 （1）microRNA-Let-7a和microRNA-34a外購于GenePharma（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），分別對A549和NCI-H446進行轉(zhuǎn)染，48～72h收集細胞；（2）MTT（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide）方法檢測每組細胞的增殖狀態(tài)；（3）使用提取的總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄作用合成cDNA；（4）細胞周期及細胞凋亡情況采用流式細胞術(shù)加以分析；（5）常規(guī)的Western blot方法[2]評價C-myc、bcl2和P53的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料用“x±s”表示，多組計量資料組間比較采用F進行檢驗，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

成功轉(zhuǎn)染了外源小RNA let-7a和34a至肺癌A549和NCI-H446兩株細胞系內(nèi)，將各組數(shù)據(jù)進行對比，其中2個試驗組的細胞增殖在48h后明顯被抑制，細胞凋亡情況明顯高于對照組（P＜0.05）；細胞周期在G0/G1期停滯，試驗組內(nèi)停留于G0/G1的細胞百分比也明顯高于對照組（P＜0.05）；蛋白表達方面，C-myc、bcl2在Let-7a轉(zhuǎn)染組的表達水平明顯下降（P＜0.05）；P53的表達水平在34a轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)升高趨勢（P＜0.05）。見表1、表2。

表1 A549細胞系各組數(shù)據(jù)比較（x±s，%）

表2 NCI-H446細胞系各組數(shù)據(jù)比較（x±s，%）

3 討論

近年來，通過專家和學者的不斷研究發(fā)現(xiàn)[3]，micro RNA一方面是通過抑制信使RNA的轉(zhuǎn)錄，另一方面是通過誘導信使RNA的降解，產(chǎn)生抑制基因表達的作用，進而參與到調(diào)控細胞發(fā)育分化及凋亡的過程中。micro RNA可能導致某靶基因的活化，也可能致使某些基因沉默，表現(xiàn)出來的形式便是導致疾病的發(fā)生或抑制疾病的發(fā)展。

在所有的 micro RNA調(diào)控因子中，本研究圍繞microRNA-Let-7a和microRNA-34a對肺癌細胞系的作用及其分子機制進行了分析。實驗結(jié)果表明，被microRNA-Let-7a和microRNA-34a轉(zhuǎn)染了的肺癌A549和NCI-H446細胞系中70%左右細胞的細胞周期停滯于G0/G1期，對照試驗組在50%～60%，明顯抑制了肺癌細胞的生長和分化（P＜0.05），進而誘導了細胞的凋亡。

在腫瘤細胞中C-myc和bcl2為異常表達蛋白，其家族基因即所謂的癌基因，而P53的基因為一種抑癌基因，具有抗癌作用[4]。所以，評價C-myc、bcl2和P53的表達水平可以進一步分析microRNA-Let-7a和microRNA-34a的抑癌作用機制。試驗結(jié)果表示，在microRNA-Let-7a轉(zhuǎn)染的細胞中，C-myc和bcl2的表達明顯下降，在microRNA-34a轉(zhuǎn)染的細胞中P53的表達明顯增高，并且實驗用的兩株肺癌細胞系的表現(xiàn)情況相同。

近期科學家化學合成雙鏈RNA模擬物（RNAs mimics）作為內(nèi)源基因轉(zhuǎn)染入細胞[5-6]。從蠕蟲到人類MicroRNA let-7家族在不同物種間均具有高度的保守性，在腫瘤細胞中其所在的染色體區(qū)域通常會被刪除。在人體中包括了MicroRNA let-7的家族成員有Let-7a、a-2、a-3、7b、7c、7d、7e、f7-1、f7-2、7g、7i、mir-98、andmir-202。MicroRNA-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c三者構(gòu)成[7]，miR-34a由其獨有的基因轉(zhuǎn)錄而成。外源miR-34a可以在G1期引起細胞周期抑制，miR-34a過表達可以引起凋亡途徑的重新活化，是一種有效的腫瘤抑制基因[8]。

此次研究成功轉(zhuǎn)染了外源小RNA let-7a和34a至肺癌A549和NCI-H446兩株細胞系內(nèi)，將各組數(shù)據(jù)進行對比，其中：2個試驗組的細胞增殖在48h后明顯被抑制，所統(tǒng)計數(shù)據(jù)中，細胞凋亡情況明顯高于對照組（P＜0.05）；細胞周期在G0/ G1期停滯，試驗組內(nèi)停留于G0/G1的細胞百分比也明顯高于對照組（P＜0.05）；蛋白表達方面，C-myc、bcl2在Let-7a轉(zhuǎn)染組的表達水平明顯下降（P＜0.05）；P53的表達水平在34a轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)升高趨勢（P＜0.05）。

但是，由于目前的研究方法中主要包括：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、微針探針及細胞體外培養(yǎng)等，一些高通量的檢測手段在精密度上還不夠完善，尤其在作用分子機制方面還不夠完全清晰，所以期待不斷有新技術(shù)方法對其加以輔助。

[1] 王坦，王玉，楊廷桐.micro RNA在肺癌發(fā)生發(fā)展中的研究進展[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報,2011,28(6)：784-787.

[2] 余圓蘭.布地奈德通過MicroRNA調(diào)控9HTEo-細胞增殖的分子機制研究[D].重慶醫(yī)科大學,2012.

[3] 劉海云.癌癥相關(guān)的microRNA檢測及成像研究[D].濟南：山東師范大學,2014.

[4] 尤嘉宗，周清華.肺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)micro RNAs的研究進展[J].中國肺癌雜志,2010,3(13)：265-269.

[5] 張強，李明遠.癌癥新策略-let-7-micro RNA家族[J].西部醫(yī)學,2009,21(7)：1210-1212.

[6] 倪娜娜.人肺癌細胞中micro RNA let-7a-1/7f-1啟動子的克隆及其功能的初步分析[D].濟南：山東大學,2012.

[7] 王坦.大鼠肺癌發(fā)生過程中micro RNA34a、P53和MDM2表達及意義[D].新鄉(xiāng)：新鄉(xiāng)醫(yī)學院,2012.

[8] 顧艷斐.micro RNAs 對肺癌細胞系生物學行為的影響及非小細胞肺癌組織中micro RNA的表達與NSCLC預(yù)后及TKls療效的分析[D].北京：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所,2013.

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.10.010

湖南 412007 株洲市中心醫(yī)院 （黃彭）