李諾

（嘉應學院 生命科學學院，廣東梅州514015）

茉莉酸甲酯對水稻種子萌發(fā)過程中蛋白酶活性影響的作用機理探討

李諾

（嘉應學院 生命科學學院，廣東梅州514015）

摘要：研究系列濃度的茉莉酸甲酯（methyl jasmonat,MeJA）、不同激素與MeJA組合對水稻種子萌發(fā)過程中所含的BAPNA酶(BAPNA：苯甲酰精氨酸對硝基苯胺,Na-benzoyl-DL-arginine-ρ-nitroanilid)活性的影響，了解水稻種子萌發(fā)過程中蛋白酶與貯藏蛋白降解的關系，探討茉莉酸甲酯是否通過赤霉素（Gibberellins，GA）或脫落酸（Abscisic acid，ABA）途徑影響水稻萌發(fā)過程中的蛋白酶活性.

關鍵詞：茉莉酸甲酯；水稻種子；蛋白酶

蛋白酶在萌發(fā)種子的貯藏蛋白降解中起重要作用，且與種子活力密切相關［1］.它的合成及活性調(diào)節(jié)一直受到人們重視.單子葉的禾本科植物中，蛋白酶活性與胚分泌激素密切相關［2］.由于水稻（Oryza sativa L.）是淀粉質(zhì)種子，對水稻種子萌發(fā)過程中蛋白酶的合成和活性調(diào)節(jié)方式了解較少.在種子萌發(fā)過程中，貯藏蛋白可能被多種蛋白酶水解，以供應種子萌發(fā)時對氨基酸的需求.不少研究表明茉莉酸甲酯與脫落酸都能抑制種子萌發(fā)，其作用機理也一樣，但對水稻種子而言，脫落酸的抑制作用強于茉莉酸甲酯［3］.Tsai等認為脫落酸抑制水稻幼苗生長是可逆的，而茉莉酸甲酯的抑制作用是不可逆的［4］.水稻種子萌發(fā)過程中，蛋白酶基因的表達和調(diào)控受到多種激素影響，并可能存在不同的調(diào)控途徑.本文通過三種常用的檢測蛋白酶活性的底物：苯甲酰精氨酸對硝基苯胺、酪蛋白、偶蛋清蛋白，探討茉莉酸甲酯對水稻種子萌發(fā)過程中蛋白酶活性影響是否通過赤霉素途徑.

1　　材料與方法

1.1材料

本實驗所用水稻（Oryza sativa L.）品種為“桂農(nóng)占”，由廣東省農(nóng)科院水稻研究所提供；茉莉酸甲酯由日本ZEON公司贈送；多效唑（PP333）的15%可濕性粉劑由華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院提供；其它激素均購自上海生化試劑廠.

1.2水稻種子萌發(fā)處理

選取顆粒飽滿無菌斑的水稻種子用5%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水清洗6次，放入已滅菌的墊有一層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，并加入適量無菌水，每個培養(yǎng)皿放置100粒水稻種子，培養(yǎng)7天（28±1℃），培養(yǎng)期間定時觀察，根據(jù)實際情況添加或更換培養(yǎng)液.

1.3形態(tài)指標測定

計算水稻種子的萌發(fā)率.

1.4粗酶液的提取

分別取20粒正常萌發(fā)的與去胚處理的水稻種子，加入10 mL pH7.2,0.02 mol/L磷酸緩沖液（含10 mmol/Lβ－巰基乙醇），研磨成勻漿，4℃、5 000 g、離心10 min，取上清液得到粗酶液.

1.5酶活性的測定（BAPNAase酶活性的測定）

以BAPNA作為反應底物，按照Doi等的方法進行測定［5］.以波長410 nm下的OD值每分鐘增加0.001 為1個酶活性單位.

1.6鹽溶蛋白含量的測定

鹽溶蛋白用10%NaCl提取，按照Bradford［8］的方法測定蛋白質(zhì)含量，用牛血清白蛋白做標準曲線.

1.7谷蛋白含量的測定

參照賓金華等的方法［6］，用0.2%NaOH提取堿溶蛋白，堿溶蛋白減去鹽溶蛋白即為谷蛋白.按照Bradford的方法測定蛋白質(zhì)含量［13］，用牛血清白蛋白做標準曲線.

1.8 各種處理及其相對應的表示符號

表1　　培養(yǎng)水稻種子的各種溶液以及相應的表示符號

以上實驗均重復三批處理，每批處理重復三次，取平均值.

2　　結(jié)果與分析

2.1 各種處理對水稻萌發(fā)的影響

與水對照相比，除了A(4)和M(7)+A(4)處理之外，其它各種處理的萌發(fā)率都達到97%以上（見圖1），A(4) 和M(7)+A(4)處理降低了水稻種子的萌發(fā)率，M(7)+A(4)處理的萌發(fā)率略高于A(4)處理，說明10-4mol/L ABA抑制水稻種子的萌發(fā)，10-7mol/L MeJA能緩解10-4mol/L ABA的抑制作用，但10-5mol/L ABA的抑制作用不很明顯.表明只有10-4mol/L ABA對水稻種子的萌發(fā)率有明顯影響.

圖1　　各種處理對水稻種子萌發(fā)的影響

2.2各種處理對水稻種子萌發(fā)過程中以BAPNA為底物的蛋白酶活性的影響

各種處理對BAPNA酶活性沒有明顯影響，其中M(4)和G(4)處理對BAPNA酶活性有輕微促進作用，而M(7)、P(3)、P(4)、A(4)、A(5)處理有輕微的抑制作用；當M(7)分別與P(3)、P(4)、A(4)、A(5)的組合時，M(7)對BAPNA酶活性卻表現(xiàn)出輕微促進作用，如圖2所示.

圖2　　各種處理對萌發(fā)水稻種子鹽溶蛋白含量的影響

2.3各種處理對萌發(fā)水稻種子鹽溶蛋白含量的影響

M(4)、M(7)處理的鹽溶蛋白含量略高于水處理，P(3)、P(4)、A(4)、A(5)分別與M(7)的組合處理的鹽溶蛋白含量都要比它們本身單獨處理時高，如圖3所示.這與蛋白酶活性的現(xiàn)象有點相似，MeJA對鹽溶蛋白的降解具有一定的抑制作用，而M(4)和G(4)處理的鹽溶蛋白含量與M(4)+G(4)處理的含量并無明顯差異.

2.4各種處理對萌發(fā)水稻種子谷蛋白含量的影響

與水對照相比，僅有M(7)、G(4)處理的谷蛋白含量略低.P(3)、P(4)、A(4)、A(5)分別與M(7)的組合處理的谷蛋白含量都要比它們本身單獨處理時低，M(4)處理的谷蛋白含量高于水對照，如圖4所示.M(4)、G(4)處理的谷蛋白含量和M(4)與G(4)組合處理的含量無明顯差異.這表明G(4)能夠輕微促進谷蛋白的降解，但不能逆轉(zhuǎn)M(4)抑制谷蛋白的降解.M(7)對谷蛋白降解有輕微的促進，而P(3)、P(4)、A(4)、A(5)表現(xiàn)出明顯的抑制，10-7mol/L MeJA促進水稻種子萌發(fā)與谷蛋白的降解相關.

圖3　　各種處理對萌發(fā)水稻種子鹽溶蛋白含量的影響　

圖4　各種處理對萌發(fā)水稻種子谷蛋白含量的影響

3　　討論

本實驗分別檢測了赤霉素、脫落酸、多效唑及其與茉莉酸甲酯的組合對水稻種子萌發(fā)過程中蛋白酶活性的變化及貯藏蛋白降解情況.實驗結(jié)果顯示M(7)對BAPNA酶活性的促進作用可能受內(nèi)源赤霉素抑制，高濃度（10-4mol/L）的茉莉酸甲酯對BAPNA酶有輕微的促進作用，并能部分抑制赤霉素引起的BAPNA酶活性升高.因此，可以認為在水稻種子正常萌發(fā)的時候，由內(nèi)源赤霉素調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導途徑可能在BAPNA酶活性表達中起主要作用.從各種處理的水稻種子的鹽溶蛋白含量來看，茉莉酸甲酯對鹽溶蛋白的降解具有一定的抑制作用，并比P(3)、P(4)的抑制作用要強，比A(4)、A(5)的抑制作用要弱，M(4)和G(4)單獨處理的鹽溶蛋白含量與兩者組合處理的含量無明顯差異.從各種處理的谷蛋白含量來看，M(4)抑制谷蛋白的降解，M (7)表現(xiàn)輕微促進谷蛋白的降解，P(3)、P(4)、A(4)和A(5)對谷蛋白降解表現(xiàn)抑制，G(4)對谷蛋白的降解也有一定的促進作用.結(jié)合種子萌發(fā)、蛋白酶活性的變化和貯藏蛋白的降解情況來看，可以認為10-7mol/L茉莉酸甲酯可能通過提高內(nèi)源赤霉素水平，促進蛋白酶活性提高，從而誘導谷蛋白的修飾與降解，為水稻種子萌發(fā)提供必需的氮素營養(yǎng)，實現(xiàn)對水稻萌發(fā)的促進作用.

參考文獻：

［1］賓金華，傅家瑞.不同活力花生種子子葉內(nèi)肽酶活性及花生球蛋白的降解［J］.熱帶亞熱帶植物學報,1995,3(3)：79-83.

［2］Shutov A D，Vaintraub I A.Degradation of storage protein in germinating seeds［J］.Phytochem,1987(26)：1557-1566.

［3］Wilen R W，Ewan B E,Gusta L V.Interaction of abscisicacid and jasmonic acid on the inhibition of seed germinationand the induction of freezing tolerance［J］.Can Bot,1994(72)：1009-1017.

［4］Tsai F Y，Lin C C，Kao C H.A comparative study of theeffects of abscisic acid and methyl jasmonate on seedlinggrowth of rice ［J］.Plant Growth Reg,1997(21)：37-42.

［5］Doi E，Shibata D，Matoba T，et al.Evidence for thepresence of two types acid proteinases in germinating seedsof rice［J］.Agric Biol Chem,1980(44)：435-436.

［6］賓金華，黃勝琴，何樹春，等.茉莉酸甲酯對水稻種子萌發(fā)和貯藏物質(zhì)降解的影響［J］.植物學報,2001,43(6)：578-585.

（責任編輯：閆文龍）

中圖分類號：O29；F830.9

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5348（2015）08-0041-04

［收稿日期］2015-06-02

［基金項目］2014年廣東省高等教育學會實驗室管理專業(yè)委員會基金項目（GDJ2014076）.

［作者簡介］李諾（1979-），女，廣東梅州人，嘉應學院生命科學學院講師，碩士；研究方向：植物學.

Effects of Methyl Jasmonate on the Protease Activities During Rice （Oryza sativa L.）Germination

LI Nuo
（College of Life Sciences,JiaYing University，Meizhou 514015,Guangdong,China）

Abstract：The effects of methyl jasmonate(MeJA),MeJA combining other phytohormones and different inhibitors of proteases on the protease activities of germinated rice seeds or cultured embryoless rice grains were studied. It concluded that MeJA maybe influence the de novo synthesizing of the cysteine protease and then influence the germination of rice seeds.

Key words:methyl jasmonate;rice seeds;protease