徐烈雨，廉建坡，陳東寧，祝 宇，趙菊平，吳瑜璇，沈周俊，寧 光

（上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院：1．泌尿外科；2．內(nèi)分泌科 上海 200025）

腎上腺皮質癌惡性程度高，病程進展迅速，早期診斷較困難；目前針對腎上腺皮質癌的發(fā)病機制尚未闡明，尤其對于進展期暫時缺乏有效的治療手段。表皮生長因子受體（epiderminal growth factor receptor，EGFR）是一種跨膜糖蛋白，主要由膜外配體結合區(qū)、單鏈跨膜區(qū)及高度保守的膜內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)組成；其相關信號通路涉及細胞生長、分化、增殖、凋亡等多方面。已有的研究表明在腎上腺皮質癌腫瘤中EGFR呈過表達，同時EGFR高表達也提示皮質癌腫瘤的惡性分型以及預后不良［1－2］；體外實驗也驗證抑制EGFR信號通路后能促進ACC細胞系凋亡，起到一定程度的抑制作用。

埃羅替尼（Erlotinib）是一類EGFR小分子抑制劑；其對腎上腺皮質癌細胞尚不明確。本文將重點觀察埃羅替尼對腎上腺皮質癌SW13細胞系信號通路、增殖、凋亡和細胞周期的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1．1 主要材料①細胞：人腎上腺皮質癌細胞株SW13購自上海中科院細胞庫；②藥物：埃羅替尼購自美國Selleck公司；③試劑：ERK、mTOR、p－ERK、p－mTOR抗體（CST公司，美國），DMEM 高糖培養(yǎng)基及新生肽牛血清（Gibco公司，美國），碘化丙叮（PI）、四甲基偶氮唑（MTT）、DMSO（Sigma公司，美國）；④儀器：流式細胞儀 LSRII（BD Bioscience），各種規(guī)格培養(yǎng)皿（Corning Costar，美國）。

1．2 細胞培養(yǎng)SW13細胞系接種于96孔板（MTT）或者6cm培養(yǎng)皿（流式細胞儀和蛋白檢測），DMEM基質，10%胎牛血清（體積分數(shù)）以及1%的雙抗，37℃、5%CO2恒溫孵箱常規(guī)培養(yǎng)，當細胞密度達到70%～80%左右用于MTT或者流式試驗。

1．3 MTT法檢測細胞活力取對數(shù)生長期SW13細胞以6．0×103／孔密度接種于96孔板，每組設置5個復孔，分別于加相應濃度藥物（1、2．5、5、10、25、50、125μmol／L）后12、24、48、72h后測定細胞活力，加入200μL／孔10%MTT，避光37℃恒溫孵箱培養(yǎng)4h后吸去培養(yǎng)基中 MTT，然后加入100μL／孔DMSO，室溫搖床放置10min，與酶標儀測定各孔吸光值（570nm），繪制細胞生長曲線。實驗重復3次，按下述公式計算細胞存活率，細胞存活率（%）＝（實驗組A－空白組 A）／（陰性組 A－空白組 A）×100%。

1．4 細胞凋亡檢測 將處于對數(shù)生長期的SW13細胞以3．5×105／孔密度接種于6孔板，加入相應濃度藥物（5、20μmol／L）后24h收集細胞，用無 EDTA的胰酶處理消化SW13細胞系，14 000r／min×5min離心后去上清，加入Binding緩沖液60μL／孔重懸，制成單細胞懸液；加入3．8μL FITC－AnnexinV混勻靜置10min，再加入3．8μL PI混勻后室溫避光反應10min。上機前每孔各加入Binding緩沖液120μL，混勻與流式細胞儀上機，檢測細胞凋亡情況；重復3次實驗。

1．5 細胞周期測定將處于對數(shù)生長期的細胞以3．5×105／孔密度接種于6孔板，加入相應濃度藥物后24h收集細胞，按照周期試劑盒測定標準流程操作，使用BD流式細胞儀分析軟件，重復3次實驗。

1．6 蛋白檢測收集相應濃度藥物處理的SW13細胞，分別加入 RIPA、Cocktail、PMSF（體積比100∶10∶1），冰上裂解30min，后4℃12 000r／min離心30min，收集上清液后于酶標儀BCA定量后以4×Loading液99℃煮沸5min，于－20℃保存。取蛋白于10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，100V恒壓轉膜120min后以3%BSA封閉1h后，一抗（3%BSA稀釋1∶1 000）4℃孵育過夜；PBST洗滌三次后與相應種屬二抗（3%BSA稀釋1∶10 000）孵育1 h后機器顯影，每次實驗重復3次。

1．7 統(tǒng)計學分析應用SPSS 17．0統(tǒng)計分析軟件，結果以±s表示，使用配對t檢驗來分析兩群細胞之間的差異，P＜0．05認為差異有統(tǒng)計學意義，以Graphpad Prism 5．0軟件作圖。

2 結 果

2．1 埃羅替尼呈濃度－時間相關地抑制SW13細胞增殖通過MTT實驗結果顯示，培養(yǎng)12、24、48、72 h后，1～125μmol／L濃度的埃羅替尼分別可以抑制SW13細胞增殖，各組與12h處理組相比均有統(tǒng)計學差異。其中，作用24h時，1μmol／L埃羅替尼約抑制20%左右的SW13活力，當濃度增加到25 μmol／L時，抑制率可達50%，提示埃羅替尼可以呈劑量相關地抑制細胞增殖；同樣，當25μmol／L埃羅替尼處理12h時，其抑制率約為45%，但當作用時間增加到48h時，抑制率可達70%，進一步證實埃羅替尼抑制增殖效率與時間相關 （圖1）。

圖1 通過MTT實驗檢測一定濃度和時間的埃羅替尼可以抑制SW13細胞增殖24、48、72h與12h結果比較，＊＊P＜0．01

2．2 埃羅替尼可以誘導SW13細胞凋亡流式細胞檢測結果顯示，處理24h后，空白組、5μmol／L組、20μmol／L埃羅替尼處理組早期凋亡率（AnnexinV＋／PI－）分別為（1．62±0．21）%、（3．35±0．46）%及（13．49±0．48）%，與空白組對比，分別增加約2倍及8．5倍，提示有效治療濃度的埃羅替尼可以誘導SW13細胞凋亡；而晚期凋亡率（AnnexinV＋／PI＋）三組分別為（0．98±0．14）%、（0．71±0．11）%、（4．80±0．58）%，提示高濃度埃羅替尼可以促進細胞壞死凋亡（圖2，表1）。

圖2 通過AnnexinV－PI流式檢測埃羅替尼可以誘導SW13細胞凋亡

表1 埃羅替尼誘導SW13細胞凋亡

2．3 埃羅替尼對SW13細胞周期無影響通過PI細胞周期實驗顯示，空白組、5μmol／L組、20μmol／L埃羅替尼組處理24h后，細胞周期無明顯改變，G1期均約為70%左右，而G2期則為25% 左右，S期為5%～7%左右，統(tǒng)計學無差異（圖3），提示埃羅替尼對SW13細胞周期無明顯影響。

圖3 埃羅替尼對SW13細胞周期無影響

2．4 埃羅替尼對EGFR下游信號通路蛋白表達的影響，抑制p－ERK蛋白表達水平，不影響p－mTOR通過Western blot檢測EGFR下游信號通路蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)空白組、5μmol／L組、20μmol／L埃羅替尼組處理24h后埃羅替尼能夠顯著降低ERK磷酸化表達水平，并呈劑量相關性；而同樣，另一條EGFR下游通路mTOR通路則無明顯改變 （圖4）；提示埃羅替尼主要通過ERK通路影響細胞增殖及凋亡。

圖4 埃羅替尼影響EGFR下游mTOR及ERK通路水平

3 討 論

腎上腺皮質癌（adrenocortical carcinoma，ACC）是起源于腎上腺組織的惡性腫瘤，發(fā)病率低，病死率高［3］；ACC的臨床診斷主要依靠影像學及內(nèi)分泌檢查，確診則需依靠病理檢查，總體看來腎上腺皮質癌治療預后不佳。目前尚無有效的治療方法，對于部分病例，臨床上外科手術切除可以作為主要治療方法；除此之外，對于進展期ACC，米托坦聯(lián)合細胞毒性藥物等為其一線治療方案，但總體治療效果依然有限，腫瘤分期Ⅳ期或者術后復發(fā)的ACC患者5年生存率不足5%［4－5］；但是如不施行保守治療，進展期患者平均生存期僅為3～9個月［6］。

表皮生長因子受體生理情況下可以誘導正常的有絲分裂反應、促進細胞分化、遷移與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等，而其表達異常亦與惡性腫瘤細胞增殖、粘附、血管形成、轉移等密切相關，一直是抗腫瘤分子靶向治療做深入的熱點之一。配體通過與EGFR結合導致其二聚體話，激活了RAS／MAPK、PI3K等多條信號轉導通路，EGFR可以通過這些通路調(diào)節(jié)細胞分化、增加細胞侵襲力、促進血管生成等。人們已經(jīng)在多種實體瘤如乳腺癌、結直腸癌、膀胱癌、腎癌中檢測到EGFR的過表達［7］；同樣，ADAM 等［2］通過對161例 ACC標本進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，超過90%的ACC腫瘤組織EGFR表達強陽性，而33例腎上腺腺瘤中32例表達陰性，另外5例正常腎上腺組織表達全部陰性。

埃羅替尼是一種小分子靶向治療腫瘤藥物，可以特異性地抑制EGFR信號轉導通路，最早于2004年11月經(jīng)美國FDA批準用于一線化療失敗的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌的治療，2006年引進國內(nèi)。當應用于腎上腺皮質癌SW13細胞系時，可以明顯地呈濃度－時間相關地抑制腫瘤細胞增殖（圖1），當作用24h時，埃羅替尼的IC50為20．51μmol／L，當濃度增加到50μmol／L時，已能夠大約抑制70%；而當作用72h時，即便1μmol／L的埃羅替尼已能夠抑制約60%的細胞活力。

同時，我們進一步通過流式細胞學技術，試圖探討埃羅替尼是否還可以通過影響細胞凋亡及周期來抑制腫瘤增殖，圖2可以看出與空白組對比，5μmol／L埃羅替尼可使SW13早期凋亡率增加約2倍；當濃度增加到20μmol／L時，SW13細胞早期凋亡率可達13．49%，增加8．5倍；同樣的現(xiàn)象也發(fā)生在晚期凋亡／壞死的比率上，驗證一定治療劑量的埃羅替尼可以呈濃度相關地誘導SW13細胞早期凋亡、促進細胞壞死。除此之外，通過觀察細胞周期實驗，我們發(fā)現(xiàn)埃羅替尼并不能有效地影響SW13細胞周期，可能提示埃羅替尼抑制腫瘤增長可能與細胞周期無關（圖3）。

EGFR主要通過RAS／MAPK及PI3K／mTOR兩條信號通路來調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長、分化等，因此我們推測EGFR小分子抑制劑埃羅替尼可能通過這兩條通路來影響SW13細胞增殖，通過上述兩種濃度的埃羅替尼處理SW13細胞24h后檢測ERK、mTOR磷酸化及總蛋白的表達量，我們發(fā)現(xiàn)埃羅替尼可以明顯地降低ERK蛋白磷酸化水平，提示其可能通過RAS／ERK信號通路來抑制SW13細胞增殖（圖4）。另一方面，治療劑量的埃羅替尼并不能影響mTOR蛋白磷酸化水平，其原因可能是兩方面：①MORGILLO等［8］曾報導埃羅替尼在非小細胞肺癌細胞系中能同時抑制RAS／ERK及PI3K兩條通路的激活，從而抑制相應細胞系增殖；但埃羅替尼可能在SW13細胞系中不通過PI3K／mTOR信號通路抑制細胞增殖，而僅僅通過RAS這條信號通路；②SW13細胞經(jīng)埃羅替尼處理后，可能出現(xiàn)了PI3K／mTOR信號通路的補償激活，既往研究亦多次報導IGF1R與EGFR 之間的交聯(lián)存在［8－9］。

雖然本實驗發(fā)現(xiàn)了EGFR小分子抑制劑埃羅替尼對于腎上腺皮質癌SW13細胞系的抑制增殖、促進凋亡等作用，但既往人們嘗試將吉非替尼單用、埃羅替尼聯(lián)合吉西他濱應用于臨床治療時，并未獲得較好的緩解率［10－11］，可能提示單用EGFR抑制劑并不能獲得良好的治療效果；另外，本實驗結果提示EGFR下游信號通路可能存在與其他生長因子下游通路之間的交聯(lián)，并結合其他報道［9］，提示將來可能將EGFR抑制劑與其他相關酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)用能達到一定的治療效果。

本研究通過體外應用埃羅替尼作用于腎上腺皮質癌SW13細胞系，從細胞增殖、凋亡、周期及信號通路等多個角度研究埃羅替尼對于ACC腫瘤的影響，揭示了埃羅替尼抑制SW13細胞腫瘤增殖的作用，為臨床進一步將EGFR抑制劑藥物聯(lián)合其他靶向治療藥物應用于腎上腺皮質癌治療提供了相關的理論依據(jù)。

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