田洪成，馬良宏，馬會明，馬文智，馬 璐，李苗苗，李培軍，裴秀英，王燕蓉

（1．寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院泌尿外科，寧夏銀川 750004；2．寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室，寧夏銀川 750004）

環(huán)磷酰胺（cytoxan，CTX）目前作為臨床一線用藥被廣泛用于腫瘤以及自身免疫性疾病的治療［1］。然而，1971年，WORTH［2］首次報道了CTX治療淋巴瘤所致的膀胱移行上皮癌，此后，CTX導致泌尿系上皮腫瘤的報道相繼出現(xiàn)［3－5］。有人統(tǒng)計CTX用藥后12年膀胱癌的累積發(fā)病率高達（10．7±4．9）%［4］。目前，CTX誘導膀胱腫瘤的機制鮮見報道。KI67蛋白用于判斷細胞增殖活性［6］，P53基因是一種腫瘤抑制基因［7］，P21蛋白抑制細胞周期［8］。三個基因與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本實驗通過對這三個蛋白的檢測，探討CTX誘導膀胱癌的機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague Dawley，SD）大鼠6只雄性、6只雌性，共12只，由寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心［無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級］提供，隨機分為處理組和對照組各6只，每組雄雌各半。

1．2 主要試劑和儀器CTX購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，P53、P21抗體均購自 Abcam公司，KI67抗體購自Santa Cruz公司，山羊血清工作液、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，上樣緩沖液、SDS－PAGE配膠試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，脫脂奶粉購自完達山企業(yè)集團乳品有限公司，二抗、超敏ECL化學發(fā)光底物購自博士德生物、蛋白提取試劑盒購自凱基生物有限公司。

1．3 模型建立及標本制備處理組大鼠給予CTX 100mg／kg腹腔注射［9］，對照組給予同等劑量的生理鹽水腹腔注射，24h后給予麻醉致死量的戊巴比妥鈉無菌取膀胱，膀胱在正中切開。解剖位左側(cè)膀胱置于－80℃保存；右側(cè)膀胱置于4%（體積分數(shù)）的多聚甲醛中固定24h，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（5μm），用于HE染色和免疫組織化學檢測。

1．4 HE染色60℃恒溫烤箱烤片2h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ10min，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ及95%、90%、85%、80%、70%乙醇各5min，水洗5min，蘇木精10min，自來水沖洗1min，1%鹽酸酒精分化10s，自來水沖洗返藍15min，0．5%伊紅染色20min，水洗浮色，70%、80%、85%、90%、95%、無水乙醇各10s、10s、3～5min、5min、5min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min，中性樹膠封片。

1．5 免疫組織化學檢測 60℃恒溫烤箱烤片2h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ20min，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ，95%、90%、85%、80%、70%乙醇各5min，水洗5min，PBS洗3次，每次5min。0．01mol／L枸櫞酸緩沖液抗原修復2次，每次15min，室溫充分冷卻，PBS洗3次，每次5 min。3%H2O2避光室溫孵育10min，PBS洗3次，每次5min。山羊血清工作液室溫封閉1h，滴加一抗（KI67／P53／P21）工 作 液 （1∶100／1∶200／1∶200），室溫30min，4℃過夜。以PBS代替一抗作為陰性對照。室溫復溫1h，PBS洗3次，每次5min。按照試劑盒說明書，滴加試劑1（聚合物輔助劑），37℃孵育20min，PBS洗3次，每次5min。滴加試劑2（辣根酶標記山羊抗兔／小鼠IgG多聚體），37℃孵育30min，PBS洗3次，每次5min。DAB顯色。蘇木精復染，脫水、透明，中性樹膠封片。

1．6 Western blot檢測常規(guī)蛋白提取、BCA檢測蛋白濃度、添加上樣緩沖液、煮沸5min，－80℃保存。SDS－PAGE電泳；100V轉(zhuǎn)移1h轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉室溫在搖床封閉1h；一抗孵育：將β－actin按1∶10 000比例稀釋，P53／P21／KI67按1∶1 000／1∶1 000／1∶500比例稀釋，室溫搖床孵育90min，回收一抗，加入TBST洗滌3次，每次5min；二抗孵育：山羊抗兔二抗按1∶10 000稀釋，室溫搖床孵育60 min，回收二抗，加入TBST洗滌3次，每次5min；滴加超敏ECL化學發(fā)光底物、暗室曝光。

1．7 數(shù)據(jù)分析采用SPSS11．0統(tǒng)計軟件，兩組之間比較采用t檢驗。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2．1 兩組HE染色結(jié)果比較CTX處理組膀胱黏膜皺襞減少、腫脹，細胞排列雜亂，呈現(xiàn)單層分布，膀胱黏膜處呈現(xiàn)毛刺樣改變；對照組膀胱皺襞多、黏膜細胞排列均勻，呈現(xiàn)3～4層分布，表面平滑。見圖1。

圖1 兩組大鼠CTX處理后膀胱組織染色結(jié)果（HE，×200）

2．2免疫組織化學染色檢測KI67、P53、P21的蛋白表達量KI67蛋白表達主要表達在膀胱黏膜細胞的細胞核，CTX處理組明顯高表達（圖2）；P53蛋白表達主要表達在膀胱黏膜細胞的細胞核，CTX處理組明顯低表達（圖3）；P21蛋白表達在膀胱黏膜細胞的細胞核和胞漿中均有表達，CTX處理組明顯低表達（圖4）。

圖2 兩組大鼠CTX處理后KI67蛋白膀胱黏膜表達（SP，×400）

圖3 兩組大鼠CTX處理后P53蛋白膀胱黏膜表達（SP，×400）

圖4 兩組大鼠CTX處理后P21蛋白膀胱黏膜表達（SP，×400）

2．3 Western blot檢測及數(shù)據(jù)分析蛋白印跡檢測，CTX組與對照組相比，KI67蛋白表達高（圖5A）、P53蛋白表達低（圖5B）、P21蛋白表達低（圖5C），差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

圖5 兩組KI67、P53、P21灰度定量及蛋白表達柱狀圖及其蛋白印跡檢測圖

3 討 論

CTX導致突變的能力很強，研究報道，CTX在體內(nèi)代謝可生成明丙烯醛和氯乙醛，這兩種代謝物通過消耗細胞內(nèi)的谷胱甘肽（Glutataione，GSH）引起膀胱的損傷［10］。然而，GSH的耗竭可以導致DNA的損傷［11］，進而導致腫瘤的發(fā)生［12］。

KI67基因在第10號染色體上，蛋白產(chǎn)物定位在細胞核，是一種普遍認可的細胞增殖特異性相關(guān)核抗原，主要用于判斷細胞增殖活性，在G1后期開始表達，在S期和G2期慢慢升高，M期達到頂峰，G0期無表達，在有絲分裂結(jié)束后迅速降解消失［13］。研究發(fā)現(xiàn)，KI67在肺癌、胃癌、肝癌以及其他惡性腫瘤中均是過表達［14］。同時，KI67的表達高低對研究腫瘤的特性及預后具有重要作用［13－14］。本實驗中，CTX處理組膀胱黏膜KI67過表達，說明CTX處理后，膀胱黏膜細胞的增殖能力增強。

P53基因是目前研究最廣泛的抑癌基因，定位于人類染色體的17p13．1，是細胞生長周期中重要的負調(diào)節(jié)因子［7］。P21基因是細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子家族成員之一，定位于胞質(zhì)和細胞核，其具有最廣泛的激酶抑制活性［8］。P21基因位于P53基因的下游，兩者共同構(gòu)成了細胞周期的G1檢查站［15］。當DNA 受到損傷時，P53蛋白可以阻止DNA的復制，提供足夠的時間使得損傷的DNA修復，如果修復失敗，P53蛋白可以引起細胞凋亡，如果P53基因的兩個拷貝點都發(fā)生了突變，對細胞的增殖失去控制，導致細胞的癌變［16］。P21可以抑制cyclinE－CDK2和cyclinD1－CDK4的活性，從而使得Rb蛋白不能發(fā)生磷酸化，E2F不能釋放，使細胞周期停止在G1期［17］。所以，當DNA受損時，DNA的復制受到抑制，P53／P21發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，使得受損細胞有充分的時間修復，從而減少了受損DNA的累積和復制，從而抑制腫瘤的發(fā)生。本實驗中，CTX處理組P53／P21表達均降低，監(jiān)管DNA的復制抑制解除，可以使得DNA不用經(jīng)過G1期的監(jiān)測而直接進入G2期，從而造成受損DNA的累積，增加癌變的可能。同時，P53可刺激Cipt基因產(chǎn)生相對分子質(zhì)量為21×103的蛋白，該蛋白可以抑制促使細胞通過細胞周期進入有絲分裂的酶的活性，進而抑制細胞生長表達［16］。本實驗中，P53表達下調(diào)后，細胞生長抑制解除，膀胱黏膜細胞的增殖能力增強。

KI67在G1后期開始表達，它的高表達間接證明了CTX處理后，膀胱黏膜細胞的細胞周期進入G1期后的數(shù)量增多。P53／P21的低表達使得監(jiān)測G1期DNA復制的修復能力嚴重下降，從而使得CTX處理后，膀胱黏膜細胞損傷DNA的復制和累積增多，從而導致了腫瘤的發(fā)生。同時，有研究報道，CTX所致的膀胱癌患者均有較長的用藥史，短者9個月，長著達到11年［18］。在臨床上CTX導致腫瘤發(fā)生的危險性在停藥后可以持續(xù)數(shù)年［19］。這就為受損DNA的復制和積累提供了充足的時間，為腫瘤的發(fā)生提供了時間上的可能性。

總之，大鼠膀胱黏膜CTX處理后膀胱黏膜中KI67的高表達，P53／P21的低表達，為CTX誘導膀胱癌的發(fā)生提供了相關(guān)的機制。但是，疾病的發(fā)生是受多因素影響的，其他相關(guān)機制需要繼續(xù)的探索。

［1］ZHANG Y，WU G，HU X，et al．Effect of cyclophosphamide on expression of MMP－9and TGF－β1in renal tissue of rats with diabetes mellitus［J］．Cell Biochem Biophys，2015，72（2）：399－403．

［2］PEARSON RM，SOLOWAY MS．Does cyclophosphamide induce bladder cancer？［J］．Urology，1978，11（5）：437－447．

［3］HABS MR，SCHMAHLD．Prevention of urinary bladder tumors in cyclophosphamide－treated rats by additional medication with the uroprotectoos sodium 2－mercaptoethane sulfonate（mesna）and disodium2．2－dithiobis ethane sulfonute（dimesna）［J］．Cancer，1983，51（4）：606－609．

［4］潘世綸．環(huán)磷酰胺可能致膀胱癌［J］．日本醫(yī)學介紹，1990，11（6）：282．

［5］安永壽，楊勇，李炎唐．長期應用環(huán)磷酰胺誘發(fā)膀胱腫瘤臨床分析（附2例報告）［J］．現(xiàn)代泌尿外科雜志，1998，3（2）：76－78．

［6］PEREZ AA，BALABRAM D，ROCHA RM，et al．Co－expression of p16，Ki67and COX－2is associated with basal phenotype in high－grade ductal carcinoma in situ of the breast［J］．J Histochem Cytochem，2015，63（6）：408－416．

［7］費夏瑋，劉光香，祝帥，等．p53、VEGF、COX－2和 EGFR在膀胱癌組織中表達的相關(guān)性及臨床意義［J］．現(xiàn)代泌尿外科雜志，2013，18（3）：249－253．

［8］司曉宇．p21功能缺失在端粒DNA損傷所致細胞衰老與腫瘤發(fā)生中的作用研究［D］．昆明理工大學，2013：1－20．

［9］何大維，李旭良，岳麗琴，等．環(huán)磷酰胺干擾精原干細胞功能的初步研究［J］．中華男科學雜志，2006，12（5）：387－393．

［10］VANHOEFER U，SCHLEUCHER N，KLAASSEN U，et al．Ifosfamide－based drug combination ：preclinical evaluation of drug interactions and trans－lation into the cli nic［J］．Semin Oncol，2000，27（1）：8－13．

［11］朱志良，莊志雄，黃鈺．GSH在H2O2致DNA損傷中的作用研究［J］．現(xiàn)代預防醫(yī)學，2002，29（4）：518－520．

［12］RASMUSSEN MA，HOLST B，TüMER Z，et al．Transient p53suppression increases reprogramming of human fibroblasts without affecting apoptosis and DNA damage［J］．Stem Cell Reports，2014，3（3）：404－413．

［13］KAR A，KAR T，MAHAPATRA S，et al．Intra－operative cytodiagnosis of primary ovarian choriocarcinoma with Ki67immunoexpression［J］．J Cytol，2015，32（2）：139－141．

［14］楊雪琴，李雁．Ki67在乳腺癌的研究進展［J］．武漢大學學報：醫(yī)學版，2011，32（6）：852－856．

［15］TANG K，WANG C，CHEN Z，et al．Clinicopathologic and prognostic significance of p21（Cip1／Waf1）expression in bladder cancer［J］．Int J Clin Exp Pathol，2015，8（5）：4999－5007．

［16］費夏瑋，劉光香，祝帥，等．p53、VEGF、COX－2和 EGFR在膀胱癌組織中表達的相關(guān)性及臨床意義［J］．現(xiàn)代泌尿外科雜志，2013，18（3）：249－253．

［17］李向榮，林星余，肖忠秀，等．p21結(jié)構(gòu)功能與研究新進展［J］．醫(yī)學綜述，2008，14（14）：2094－2097．

［18］賈剛田．投給環(huán)磷酰胺后誘發(fā)膀胱癌的危險［J］．國外醫(yī)學·泌尿系統(tǒng)分冊，1990，10（5）：235－236．

［19］安永壽，柴文玲，安永貴，等．環(huán)磷酰胺長期應用誘發(fā)膀胱癌的危險［J］．罕少疾病雜志，2006，13（4）：45－47．