袁 晴，劉康成，黎 彪，朱佩文，林 啟，閔幼蘭，石文卿，葉 蕾，邵 毅

0引言

在細(xì)胞膜上的受體中，表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)是一種酪氨酸激酶受體，對上皮細(xì)胞的發(fā)育起著重要的作用，并在正常生理過程中扮演重要的角色。如促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和遷移等[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，EGFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)可以激活A(yù)KT細(xì)胞內(nèi)的磷酸化，從而導(dǎo)致眼部一些細(xì)胞的增殖、分化和遷移[2-4]。而埃羅替尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，其主要針對EGFR發(fā)揮作用，該抑制劑可用于非小細(xì)胞肺癌[5]、胰腺癌[6]等晚期癌癥的使用。但是，當(dāng)EGFR在抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用時[7]，可能出現(xiàn)惡心、腹痛等消化道癥狀[8]。有研究表明，埃羅替尼已知的眼部副作用是眼部表面疾病、角膜結(jié)膜炎、干眼等[9-10]，但是其對角膜的具體影響程度很難評估。

光學(xué)相干斷層掃描血管造影(optical coherence tomography angiography, OCTA)作為新型的非侵入性成像技術(shù)，能夠在極短時間內(nèi)同時對病變深度以及異常血流情況進(jìn)行評估，對于眼部病變范圍及深度有著更為直觀、精確的成像[11]，本課題組希望通過應(yīng)用OCTA對小鼠角膜上皮和角膜全層厚度的測量，探究埃羅替尼對眼表的影響，并為干眼的相關(guān)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料埃羅替尼滴眼液制備：(1)應(yīng)用無菌PBS溶液將埃羅替尼(Tarceva?，Roche，USA)稀釋至20μmol/L；(2) 超聲渦旋(37℃)均質(zhì)化；(3)加入防腐劑：0.005%苯扎溴銨；(4)4℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)動物于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心購買6～8周齡的Balb/c小鼠(均為SPF級實(shí)驗(yàn)動物)，從中選取體質(zhì)量18～21g的小鼠20只。所有小鼠經(jīng)眼前節(jié)、眼底進(jìn)行眼部相關(guān)檢查無異常。Schirmer I試驗(yàn)結(jié)果≥10mm/5min[12]。小鼠于25℃±1℃的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，明暗交替飼養(yǎng)各12h。為控制變量，所有相關(guān)操作均由一人操作完成。本次研究在充分考慮實(shí)驗(yàn)動物利益的前提下，盡可能減少對實(shí)驗(yàn)動物造成的傷害，尊重動物的生命，實(shí)驗(yàn)涉及的全部研究方法均遵循《赫爾辛基宣言》及動物倫理委員會的要求，同時獲得了南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法將所選20只小鼠隨機(jī)均分為埃羅替尼組10只，PBS組10只。埃羅替尼組應(yīng)用前述制備的埃羅替尼滴眼液5μL點(diǎn)雙眼，PBS組應(yīng)用PBS 5μL點(diǎn)雙眼，其點(diǎn)眼時間均為每日8∶00、12∶00、16∶00和20∶00。在點(diǎn)眼前和點(diǎn)眼后1、2、3wk后，應(yīng)用OCTA觀察角膜情況，測量角膜上皮和角膜全層厚度。為控制變量，所有相關(guān)操作均由一人操作完成。

1.2.1角膜區(qū)域的劃分參照文獻(xiàn)[13]，應(yīng)用AngioVue OCTA系統(tǒng)(Optovue，Inc.，F(xiàn)remont，CA)自動將角膜劃分出17個區(qū)域：按照直徑2、5、6mm劃為角膜中央(M)、內(nèi)環(huán)和外環(huán)。且內(nèi)環(huán)和外環(huán)各分為八等分：上側(cè)(S)、鼻上側(cè)(SN)、鼻側(cè)(N)、鼻下側(cè)(IN)、下側(cè)(I)、顳下側(cè)(IT)、顳側(cè)(T)、顳上側(cè)(ST)。

1.2.2 OCTA操作及數(shù)據(jù)分析參照文獻(xiàn)[13]上述角膜劃分的17個區(qū)域應(yīng)用OCTA測量其上皮和全層的局部厚度和變化量，掃描埃羅替尼組和PBS組小鼠的角膜中央直徑2mm區(qū)域和內(nèi)環(huán)、外環(huán)各分區(qū)的圖像，對雙眼數(shù)據(jù)進(jìn)行疊加，將各區(qū)域角膜上皮和角膜全層厚度的平均值制成圖形。

2結(jié)果

2.1埃羅替尼對小鼠角膜上皮厚度的影響兩組不同時間的角膜上皮各區(qū)域厚度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1、2。埃羅替尼組與PBS組相比，點(diǎn)眼前17個區(qū)域角膜上皮厚度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；點(diǎn)眼后1wk，與PBS組相比，埃羅替尼組角膜上皮下部厚度的M、IT5、I5、IN5、IT6、I6、IN6區(qū)域明顯增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；點(diǎn)眼后2wk，與PBS組相比，埃羅替尼組小鼠角膜上皮厚度的M、T5、IT5、I5、IN5、N5、T6、IT6、I6、IN6、N6區(qū)域均明顯增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與PBS組相比，點(diǎn)眼后3wk埃羅替尼組小鼠17個區(qū)域的角膜上皮厚度均明顯增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。隨著點(diǎn)眼次數(shù)的增加，點(diǎn)眼后3wk，埃羅替尼組各區(qū)域厚度較點(diǎn)眼前明顯增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.2埃羅替尼對小鼠角膜全層厚度的影響兩組不同時間各區(qū)域角膜全層厚度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。與PBS組相比，點(diǎn)眼前埃羅替尼組17個區(qū)域的角膜厚度無明顯改變，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；點(diǎn)眼后1wk，與PBS組比，埃羅替尼組小鼠角膜全層下部厚度的IT5、I5、IN5、IT6、I6、IN6區(qū)域明顯增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；點(diǎn)眼后2wk，與PBS組相比，埃羅替尼組小鼠角膜全層厚度的M、T5、IT5、I5、IN5、N5、T6、IT6、I6、IN6、N6區(qū)域均明顯增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；點(diǎn)眼后3wk，與PBS組相比，埃羅替尼組小鼠角膜17個區(qū)域全層厚度均明顯增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

2.3不同時間點(diǎn)兩組小鼠角膜上皮厚度和角膜全層厚度平均值比較兩組不同時間角膜上皮厚度平均值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=17.64，F(xiàn)時間=21.24，F(xiàn)組間×?xí)r間=12.17，均P<0.05)；兩組不同時間角膜全層厚度平均值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=6.14，F(xiàn)時間=10.65，F(xiàn)組間×?xí)r間=6.29，均P<0.05)，見表4、5。

3討論

EGFR是一種廣泛分布于角膜中的重要酪氨酸激酶受體[13]，它在眼睛發(fā)育和光受體分化中起著至關(guān)重要的作用[14-16]。EGF作為細(xì)胞因子，在角膜上皮細(xì)胞的自我更新和保持角膜微環(huán)境的穩(wěn)定性方面中發(fā)揮重要作用[17]。EGF與EGFR結(jié)合后，可以激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)蛋白磷酸化并導(dǎo)致細(xì)胞的快速分化和增殖，加速角膜損傷的愈合[18]。而埃羅替尼具有可逆性和選擇性，可以對EGFR的磷酸化和相關(guān)的酪氨酸激酶活性產(chǎn)生抑制作用，從而達(dá)到抑制細(xì)胞分裂、阻斷血管發(fā)生、引起細(xì)胞凋亡的作用[19]。以前的研究報(bào)道，結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞凋亡與干眼病密切相關(guān)[20-21]。

根據(jù)我們的研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過埃羅替尼滴眼液處理的小鼠，其角膜上皮厚度和角膜全層厚度均有不同程度的增厚，且隨著點(diǎn)眼次數(shù)的增加，其增厚的程度越為明顯。因此，我們認(rèn)為，經(jīng)埃羅替尼治療的腫瘤患者，其體內(nèi)的埃羅替尼可以進(jìn)入淚液，并對角膜產(chǎn)生刺激，阻斷EGFR信號通路的傳導(dǎo)，破壞角膜微環(huán)境的穩(wěn)定性，代償性引起角膜細(xì)胞的增殖和修復(fù)，從而產(chǎn)生和本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似的情況。Morishige等[22]也曾報(bào)道因埃羅替尼治療引起角膜穿孔的病例，這在一定程度上證實(shí)埃羅替尼對角膜微環(huán)境的穩(wěn)定性存在明顯的影響。同時有研究認(rèn)為，EGFR對角膜上皮細(xì)胞具有抑制作用，而埃羅替尼對其有著不利影響[23-24]，而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一定程度上可以證實(shí)，埃羅替尼的使用使得角膜代償性地出現(xiàn)增厚。

分區(qū)點(diǎn)眼前埃羅替尼組PBS組tP點(diǎn)眼后1wk埃羅替尼組PBS組tP點(diǎn)眼后2wk埃羅替尼組PBS組tP點(diǎn)眼后3wk埃羅替尼組PBS組tPM66±665±61.0250.09371±9?66±73.4210.04274±12?66±65.4310.02276±13?67±76.3210.020S566±765±61.0690.09270±1066±71.9740.05472±1165±82.0320.05276±12?66±84.5490.047ST565±664±51.0110.09467±966±71.0920.09271±1166±71.6450.05573±12?65±64.8950.034T570±869±91.0320.09572±1070±101.8390.08574±13?70±94.3260.03975±14?71±103.5420.042IT566±867±71.0450.09374±11?68±104.3090.03973±10?69±94.8460.03677±11?68±95.3250.033I567±867±90.9420.09975±10?67±95.4320.02378±9?68±105.5640.02079±10?68±95.9740.020IN568±868±80.9110.10073±13?68±113.2460.03474±14?68±73.5830.03276±15?68±83.6370.030N567±768±71.0210.09270±1068±81.4350.06573±11?68±93.5470.03177±12?68±103.9720.029SN566±766±70.9210.10068±867±91.3120.05972±1268±81.1640.05776±13?67±82.6790.046S667±867±71.0110.09669±1067±81.4320.07771±1167±91.4320.07071±12?68±102.5640.043ST664±764±60.9970.09865±965±71.0320.09770±1166±101.1350.05672±13?66±103.5420.039T667±868±81.2310.09570±1170±81.0210.09674±10?70±102.2490.04476±11?71±113.5190.034IT666±766±61.0210.09872±10?68±74.9320.04476±11?68±95.5620.03278±10?68±105.6530.021I668±967±91.3250.09573±11?66±105.7470.02374±11?67±105.4320.02175±11?69±104.5020.034IN661±859±81.2310.09766±11?58±95.4210.03567±12?57±106.5190.02968±13?57±105.6530.033N667±866±81.0230.09570±1067±91.5420.08974±11?66±85.4560.02277±12?68±75.4210.025SN669±769±60.9910.09970±970±61.0210.09473±1070±91.3240.05974±11?70±83.4310.044

注：從第1wk起，逐漸增加埃羅替尼的使用次數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)角膜上皮下方各區(qū)最先增厚，其他區(qū)域隨后增厚。*：埃羅替尼組點(diǎn)眼前后角膜上皮厚度明顯增厚的區(qū)域。

表2 兩組角膜上皮厚度重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果

分區(qū)角膜上皮厚度F組間P組間F時間P時間角膜上皮厚度變化趨勢F組間×?xí)r間P組間×?xí)r間M19.3210.03427.4310.0319.4350.021S521.4320.03129.8420.0239.4380.026SN518.4770.02822.4320.0229.0320.022N516.7210.02730.3540.0329.4730.028IN517.8450.02929.0430.0219.5720.031I521.4920.03531.0530.0199.7540.025IT520.4810.03930.4310.0279.5730.022T519.0470.03129.0450.0239.5820.029ST522.4810.02822.5630.0299.6310.027S615.4310.03823.5740.0338.9540.033SN619.3280.04226.5490.02710.3520.028N618.3910.04622.5140.02511.4630.019IN619.5730.03526.7420.0219.8430.022I618.9420.03723.6920.02410.7720.018IT621.0340.04122.6470.0229.4720.021T620.8410.04428.5480.0199.5610.019ST617.8380.04122.4210.0229.3240.022

干眼癥是由多種因素引起的眼部癥狀，包括淚膜不穩(wěn)定性，視力變化和潛在的眼表面損傷，減少的淚液滲透壓和增加的眼部炎癥[25]。研究發(fā)現(xiàn)，埃羅替尼在治療腫瘤的同時，導(dǎo)致了許多患者的淚管功能障礙[26]或角膜上皮性疾病[27]的發(fā)展，最終導(dǎo)致角膜糜爛，甚至出現(xiàn)溶解和穿孔的情況[10,28]。這可能是由于埃羅替尼經(jīng)淚液中到達(dá)角膜，刺激了來自于駐留的角質(zhì)細(xì)胞的蛋白酶的釋放，從而導(dǎo)致了基質(zhì)膠原蛋白的降解，從而導(dǎo)致上皮缺陷。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)[29]，埃羅替尼引起了類似于干眼病的眼表面損傷。從組織病理學(xué)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)埃羅替尼處理的小鼠角膜上皮細(xì)胞無序排列，細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰。因此，我們可以認(rèn)為，埃羅替尼的使用在一定程度可能導(dǎo)致角膜上皮損傷，炎癥等情況的發(fā)生，而這些因素都可能最終導(dǎo)致干眼癥的出現(xiàn)。

淚膜的不穩(wěn)定是導(dǎo)致干眼的重要因素，而細(xì)胞凋亡，減少的杯狀細(xì)胞和粘蛋白表達(dá)的變化均有可能導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定性增加，激活炎癥反應(yīng)，從而引起眼表上皮細(xì)胞不斷損傷[30]。此外，根據(jù)以前的研究結(jié)果，EGF對促進(jìn)杯狀細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，從而增加淚膜的穩(wěn)定性[31-32]。而埃羅替尼可能使得杯狀細(xì)胞的數(shù)量減少，導(dǎo)致杯狀細(xì)胞中粘蛋白分泌減少，造成干眼癥。

分區(qū)點(diǎn)眼前埃羅替尼組PBS組tP點(diǎn)眼后1wk埃羅替尼組PBS組tP點(diǎn)眼后2wk埃羅替尼組PBS組tP點(diǎn)眼后3wk埃羅替尼組PBS組tPF組間P組間F時間P時間M142±11141±121.1320.098147±11140±122.3110.068149±11?141±103.4530.049154±13?142±114.3410.0448.6530.01911.4360.034S5247±10248±111.0140.097256±12249±112.4390.076259±16248±112.1170.052262±18?249±114.3210.0429.7640.02113.5830.031ST5205±14203±131.3250.095210±16203±132.5630.067215±16205±132.0150.055218±19?203±134.9310.0449.5720.02211.4350.025T5180±14179±141.0110.098188±18179±142.1350.065193±17?180±143.4120.046198±18?179±144.3250.04210.5530.02817.4360.026IT5212±11211±101.0190.096221±15?212±103.5490.046223±17?213±104.2310.041226±19?211±104.3010.0410.6430.02712.6170.028I5222±14224±170.9950.098231±17?223±173.6570.045233±14?221±174.2190.04237±17?224±175.6210.02311.4320.02211.4360.022IN5209±14208±130.9140.099217±16?210±133.7520.041222±18?209±133.9320.042226±20?207±134.5210.0399.0430.01812.9530.027N5213±12212±111.1230.097218±15212±122.1270.057222±17?214±113.8140.045224±19?213±114.3210.03410.3210.02813.7530.022SN5169±13168±120.9540.097174±15168±132.3150.056179±18169±121.3210.084184±20?168±134.7310.0438.9460.02316.4390.028S6268±20266±191.0240.097272±20268±192.4190.072275±21267±192.6420.07280±22?269±194.9310.0419.3340.02112.5430.028ST6254±18254±161.0190.098256±19254±162.4330.072259±18254±162.7120.07261±19?252±164.4320.0399.0430.01713.5470.019T6217±15217±131.1930.096221±16217±142.4950.065225±18?218±153.7480.041228±19?217±155.4390.0419.4510.02212.7640.024IT6232±14234±131.0190.097238±17?234±144.1190.049242±18?233±135.0190.032244±19?236±135.9430.03110.3420.01811.5570.022I6200±14199±161.0320.098212±12?198±165.5110.033214±17?200±165.9320.022216±19?198±166.2340.029.4530.01612.5490.025IN6191±12189±130.9820.098198±16?189±154.5170.042203±19?191±135.4210.032209±21?190±135.1110.0310.6750.02214.6180.033N6193±15192±140.9140.099197±16193±141.3520.061202±17?194±144.3390.043206±19?193±134.8320.0329.7530.01913.6570.038SN6186±12188±111.1130.096190±15188±102.2170.077192±17189±112.5420.054196±18?188±113.2140.04610.2840.01811.5460.034

注：點(diǎn)眼后第1wk開始，埃羅替尼使用次數(shù)逐漸增加，角膜全層厚度逐漸變厚，且下方各區(qū)域先增厚，隨后其他區(qū)域增厚。*：埃羅替尼組點(diǎn)眼后與點(diǎn)眼前對比角膜全層厚度顯著增厚的區(qū)域。

分組點(diǎn)眼前點(diǎn)眼后1wk點(diǎn)眼后2wk點(diǎn)眼后3wkPBS組66.18±7.1766.88±7.9467.34±8.7167.41±8.88埃羅替尼組66.47±7.4770.29±10.06a72.94±11.17 a75.06±12.06 a t0.9433.2144.9655.639P0.0970.0430.0240.020

注：aP<0.05vs點(diǎn)眼前。

分組點(diǎn)眼前點(diǎn)眼后1wk點(diǎn)眼后2wk點(diǎn)眼后3wkPBS組207.82±13.41208.06±13.71208.59±13.41208.18±13.47埃羅替尼組208.24±13.71214.47±15.65218.06±17.36 a221.71±18.76 a t0.9372.3613.5494.045P0.0960.0550.0460.041

注：aP<0.05vs點(diǎn)眼前。

總之，埃羅替尼確實(shí)導(dǎo)致角膜一定程度的增厚，也在一定程度上可能導(dǎo)致了干眼癥狀的出現(xiàn)，但其造成干眼癥的機(jī)制尚未明確，需要更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究其發(fā)生的原因。